一种检测多种真菌毒素的纸基微流控芯片及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种检测多种真菌毒素的纸基微流控芯片及其制备方法，属于纸基微流控检测芯片技术领域。纸基微流控芯片为折叠纸基微流控芯片，包括三层，第一层为样品加入层，第二层为CRISPR/Cas反应层，第三层为信号检测层，每一层上均设置有亲水区和疏水区。其制备方法包括以下步骤：(1)纸基微流控芯片的制作；(2)纸基微流控芯片的功能化；(3)纸基微流控芯片同时检测的反应程序；(4)手持式便携pH计的定量分析检测。本发明专利技术采用上述的一种检测多种真菌毒素的纸基微流控芯片及其制备方法，将纸基微流控分析平台与CRISPR技术结合，用于多种真菌毒素的同时检测。该装置简单，便携，环保，价格低廉，为即时检测提供了有利的平台。为即时检测提供了有利的平台。为即时检测提供了有利的平台。

【技术实现步骤摘要】
一种检测多种真菌毒素的纸基微流控芯片及其制备方法


[0001]本专利技术涉及纸基微流控检测芯片
，尤其是涉及一种检测多种真菌毒素的纸基微流控芯片及其制备方法。

技术介绍

[0002]据联合国粮食及农业组织(FAO)估计，全球近25％的食品受到真菌毒素污染。近4.5至50亿人面临接触真菌毒素的风险，尤其是在欠发达地区。此外，由于食品在存储及加工中存在多种不确定因素，导致食品可能被多种不同毒素共同影响，造成毒素累积和潜在的毒性加和效应，危害性极高。基于食品中真菌毒素污染种类的多样性、食品安全事件的突发性、国家限量标准的严格性，因此有必要提出一种对多种真菌毒素快速、高灵敏、抗干扰的定量分析方法，以保障国民健康和社会经济利益。
[0003]目前食品中真菌毒素的定量分析方法主要有两类：以酶联免疫为基础的免疫分析法和基于色谱的仪器分析法。基于色谱的真菌毒素检测方法主要包括气相色谱、高效液相色谱及更为常用的液相二级质谱。尽管色谱法能对痕量目标物准确定量，但这些方法一般需要复杂的样品前处理、昂贵的仪器及专业的技术人员，致使测试周期较长；免疫学方法主要是基于抗原和抗体的特异性识别反应，包括使用最广泛的酶联免疫法(ELISA)以及新兴的基于荧光、电化学、化学发光等生物传感方法。虽然这些方法灵敏度高、相对快速，但是这些基于抗体的分析方法依赖抗体的质量和活性，同时需要洗涤和标记等繁琐操作，且还是需要专业化的仪器设备，不适合大批量的现场检测。因此有必要开发一种实验成本相对较低、能够对多种真菌毒素定量检测的快速分析方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种检测多种真菌毒素的纸基微流控芯片及其制备方法，该装置成本低，方便携带，可以即时检测，将纸基微流控芯片与CRISPR/Cas技术相结合，能对多种真菌毒素同时进行检测。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了一种检测多种真菌毒素的纸基微流控芯片，所述纸基微流控芯片为折叠纸基微流控芯片，所述折叠纸基微流控芯片包括第一层、第二层和第三层，所述第一层为样品加入层，所述第二层为CRISPR/Cas反应层，所述第三层为信号检测层，所述第一层、所述第二层和所述第三层上均设置有亲水区和疏水区。
[0006]优选的，所述亲水区为检测孔道，所述检测孔道设置有多个。
[0007]优选的，所述三维纸基微流控芯片的规格为25cm*25cm的色谱纸。
[0008]本专利技术提供了一种检测多种真菌毒素的纸基微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
[0009](1)纸基微流控芯片的制作；
[0010]在计算机上设计出纸基微流控芯片的图形，设计的纸基微流控芯片既可以三维折叠也可区分亲疏水区域，用于同时检测多种真菌毒素，在纸基每层可增加的孔道数目可以
依据目标物种类数量灵活设计，即可同时检测多种真菌毒素，并使用蜡打印机打印，放进烘箱中烘烤，取出冷却至室温，此目的是为了使纸张产生亲疏水区域。然后，使用小刀切割第三层的亲水区使其处于镂空状态，在镂空部分放置EP管用于收集分析液。
[0011](2)纸基微流控芯片的功能化；
[0012]将烘烤后的纸基微流控芯片，放入3％的戊二醛中浸泡一段时间，取出用去离子水冲洗表面，然后放入干燥箱干燥一段时间，干燥完成后取出待冷却至室温后，滴加50μL、5μg/mL的链霉亲和素于第一、二层的亲水区使微流控芯片的每个亲水区表面都固定有链霉亲和素，第一层用来固定带有激活链的三链核酸适配体，三链核酸适配体是一个开关的功能，与三链核酸适配体对应的真菌毒素会使其处于“开”的状态并释放激活链，无对应真菌毒素则处于“关”的状态无法释放激活链，第二层固定脲酶修饰的单链寡核苷酸。
[0013](3)纸基微流控芯片检测的反应程序；
[0014]首先将LbCas12a和crRNA结合，形成Cas12a
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crRNA，然后在功能化后的第一层固定多种真菌毒素的三链核酸适配体，三链核酸适配体的5
’
末端标记生物素与纸基微流控芯片上第一层的链霉亲和素特异性结合，第二层纸基上固定脲酶修饰的单链寡核苷酸，单链寡核苷酸的5
’
末端标记生物素与纸基微流控芯片上第二层的链霉亲和素特异性结合，然后对第一、二层的亲水区冲洗，待室温干燥后，在第一层的检测孔道加入待测样品混合液，再在第二层加入Cas12a
‑
crRNA并将第一层折叠在上面，第一层的三链核苷酸与目标靶标结合后会释放激活链，激活第二层的Cas12a对固定在此层的寡核苷酸进行切割，切割下的脲酶会透过纸基微流控芯片掉落在第三层，反应一段时间后将三层全部对叠，并在纸基微流控芯片的第一层的每个亲水区中加入100μL、0.01MpH＝7.4的磷酸盐缓冲液将Cas12a切割的脲酶冲到第三层，纸基微流控芯片第三层的EP管会收集上述分析液。
[0015](4)手持式便携pH计的定量分析检测
[0016]将纸基微流控芯片第三层的EP管取出，加入100μL尿素和10μL的酚红，可根据酚红指示剂从淡黄到紫红的颜色变化的强弱比较读出结果；利用手持式便携pH计，1min内即可读出pH值，根据pH值的变化精确地得出各种真菌毒素的浓度。
[0017]因此，本专利技术采用上述的一种检测多种真菌毒素的纸基微流控芯片及其制备方法，具有以下有益效果：
[0018](1)使用戊二醛与链霉亲和素修饰纸基微流控芯片表面使其功能化，便于核酸适配体的结合，简单省时并且有效。
[0019](2)利用修饰链霉亲和素的纸基可以与生物素化的核酸适配体特异性结合，用缓冲液冲洗可以洗去非特异性结合部分，可以极大的降低背景信号，提高检测效果。
[0020](3)该纸基微流控芯片检测的目标识别依靠三链核酸适配体，检测不同目标物时只需变换三链核酸适配体的识别部分，引物设计简单并且成本低，适合于细菌、细胞、微生物等多种目标物的检测。
[0021](4)将CRISPR技术与与纸基芯片相结合，实现了Cas12a在纸上激活并切割，省去了其他复杂的信号放大手段，提高了检测的灵敏度，构建了一种CRISPR技术与与纸基芯片的检测方法，使纸基微流控多功能化。
[0022](5)脲酶具有高度专一性，并且能够透过纸基微流控芯片，利用脲酶作为标签催化尿素水解从而将真菌浓度转化为溶液中pH变化，简单且有效，最终用手持式便携pH计实现
定量检测。其中手持式便携pH计具有价格低廉、灵敏度高及易于操作等特点，可实现即时检测。
[0023](6)整个纸基微流控芯片检测装置制备过程简单，检测快速且灵敏度高，可同时对多种真菌毒素进行检测，可用于真菌毒素的快速检测。
[0024](7)纸基微流控芯片检测装置具有简单性，便携性，低成本，无毒无害，环保，不受条件和地域限制，可用于随时随地的即时检测等优点。本专利技术将CRISPR技术与与纸基芯片结合起来，用于多种真菌毒素的同时检测。这种装置简单，便宜，便携，易于使用，为资源匮乏的地区提供了有利的平台。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测多种真菌毒素的纸基微流控芯片，其特征在于：纸基微流控芯片为三维纸基微流控芯片，所述三维纸基微流控芯片包括第一层、第二层和第三层，所述第一层为样品加入层，所述第二层为CRISPR/Cas反应层，所述第三层为信号检测层，所述第一层、所述第二层和所述第三层上均设置有亲水区和疏水区。2.根据权利要求1所述的一种检测多种真菌毒素的纸基微流控芯片，其特征在于：所述亲水区为检测孔道，所述检测孔道设置有多个。3.根据权利要求2所述的一种检测多种真菌毒素的纸基微流控芯片，其特征在于：所述三维纸基微流控芯片的规格为25cm*25cm的色谱纸。4.根据权利要求1
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3任意一项所述的一种检测多种真菌毒素的纸基微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、打印纸基微流控芯片：在计算机上设计出纸基微流控芯片的图形并打印，然后烘烤打印出的纸基微流控芯片，并将第三层的亲水区切割掉；S2、纸基微流控芯片的功能化：将烘烤后的纸基微流控芯片的亲水区用戊二醛和链霉亲和素进行固定化处理，使纸张表面固定有链霉亲和素；S3、纸基微流控芯片检测：首先在功能化后的第一层固定多种真菌毒素的三链核酸适配体，第二层固定脲酶修饰的单链寡核苷酸，然后在第一层的检测孔道加入待测样品混合液，再在第二层加入Cas12a
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crRNA并将第一层折叠在上面，30min后三层堆叠，加入磷酸盐缓冲液冲洗分析液...

【专利技术属性】
技术研发人员：全珂，张田宇，卿志和，
申请(专利权)人：长沙理工大学，
类型：发明
国别省市：