一株反硝化细菌及其应用制造技术

本发明专利技术属于微生物技术领域，具体涉及一株反硝化细菌及其应用。为解决减少N2O排放的问题，本发明专利技术的一种反硝化细菌经鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年10月17日，保藏编号为CGMCCNO.25930，用于还原N2O，减少N2O的排放。另外本发明专利技术还提供了一种含有所述反硝化细菌的微生物菌剂，该微生物菌剂还包括丛枝菌根真菌，用于降低农田N2O排放。O排放。O排放。

【技术实现步骤摘要】
一株反硝化细菌及其应用


[0001]本专利技术属于微生物领域，具体涉及一株反硝化细菌及其应用。

技术介绍

[0002]氧化亚氮(N2O)是氮循环过程中的气态产物，是一种温室气体，其增温潜力约为CO2气体的300倍，对平流层臭氧层有很强破坏作用。N2O的平均寿命可达121年，因此，大气中增加少量的N2O都会对环境造成长期影响。农田土壤是最主要的N2O排放源，年排放量可达到6.8TgN2O
‑
N，约占全球人为N2O排放总量的65％，因此减少农田N2O排放是全球氮素研究中一个重大的科学命题。
[0003]农田土壤中N2O的产生与一系列微生物过程有关，包括氨氧化、硝化细菌反硝化、亚硝酸盐氧化、异养反硝化、厌氧氨氧化和硝酸盐异化还原为铵，每一个过程都由特定的微生物调控。尽管生成N2O的途径复杂多样，但迄今为止，环境中N2O的消纳主要归因于完全反硝化微生物，完全反硝化作用最后一步将N2O还原为N2。然而，并不是所有反硝化细菌都能进行N2O还原，约1/3的反硝化细菌缺失nosZ基因(编码N2O还原酶)而无法消纳N2O。因此如何挖掘N2O还原微生物的潜力对于缓解农田土壤N2O排放至关重要。
[0004]目前针对土壤N2O减排的研究多集中于施肥管理，科学耕作，使用硝化抑制剂等。考虑到健康土壤培育和农业绿色发展的目标，筛选高效的N2O还原菌株用于微生物菌剂可以为利用有益土壤微生物进行生物减排提供新途径。在此基础上，摸清高效菌株的生长代谢规律和功能特征，充分发挥菌株N2O减排功能，是利用微生物菌剂靶向精准调控N2O还原过程的核心。

技术实现思路

[0005]针对如何减少N2O排放的问题，本专利技术提供了一株反硝化细菌及其在减少N2O排放方面的应用。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用了下列技术方案：
[0007]一种反硝化细菌，经鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年10月17日，保藏编号为CGMCC NO.25930。
[0008]一种反硝化细菌的应用，用于还原N2O，减少土壤N2O排放。
[0009]一种含有所述反硝化细菌的微生物菌剂。
[0010]所述微生物菌剂，之前发现丛枝菌根真菌和该株荧光假单胞菌联合接种可以有效降低土壤中N2O排放，本专利技术利用丛枝菌根真菌和荧光假单胞菌制成合成菌剂用于降低农田N2O排放。
附图说明
[0011]图1为反硝化细菌分离纯化结果图；
[0012]图2为基于邻接法构建的可培养反硝化细菌16S rRNA系统进化树；
[0013]图3为优势反硝化菌荧光假单胞菌nosZ基因的定性检测结果图；
[0014]图4为基于KEGG(ko00910:Nitrogen metabolism pathday)的菌株全基因组框架图序列功能注释图(注：粗体边框显示数据库比对后获得的功能注释信息)；
[0015]图5为实施例2中AMF菌丝分泌物对假单胞菌生长的影响；
[0016]图6为实施例3中AMF菌丝分泌物对假单胞菌N2O排放的影响；
[0017]图7为实施例4中有无AMF菌丝土壤N2O累计排放结果图。
具体实施方式
[0018]实施例1
[0019]本专利技术荧光假单胞菌的分离方法，包括以下步骤：
[0020]步骤1，制备培养基
[0021]溴百里酚蓝(BTB)培养基组成：柠檬酸钠5.0g L
‑1、KNO31.0 g L
‑1、KH2PO41.0g L
‑1、CaCl2·
2H2O 0.2g L
‑1、MgSO4·
7H2O 1.0g L
‑1、FeSO4·
7H2O 0.006g L
‑1，琼脂粉20g L
‑1和BTB溶液1mL，pH 7.0
‑
7.3(Takaya et al.,2003)。
[0022]反硝化培养基组成：二水合柠檬酸钠9.8g L
‑1、NH4Cl 0.63g L
‑1、NaNO30.61g L
‑1、K2HPO4·
3H2O 1.76g L
‑1、MgSO4·
7H2O 0.20g L
‑1、CaCl20.02 g L
‑1、FeSO4·
7H2O 0.005g L
‑1、0.1mL L
‑1微量元素溶液(Zhenget al.,2014)。
[0023]微量元素溶液组成：EDTA0.35 g L
‑1、ZnSO4·
7H2O 0.2g L
‑1、CuSO4·
5H2O 0.1g L
‑1、MnSO4·
7H2O 0.2g L
‑1、Co(NO3)2·
6H2O 0.09g L
‑1、H3BO30.1g L
‑1，Na2MoO40.1 g L
‑1。
[0024]Luria
‑
Bertani(LB)培养基组成：NaCl 10g L
‑1，蛋白胨10g L
‑1，酵母粉5gL
‑1，pH 7.0。
[0025]步骤2，反硝化细菌分离纯化、鉴定和保存采用BTB培养基对土壤中反硝化细菌进行分离培养、筛选和纯化，供试土壤来自不同AMF处理的新鲜土样。具体操作如下，采用两分室装置系统，分为根室和菌丝室。根室和菌丝室间通过30μm尼龙网隔开，根室种植玉米并接种10％丛枝菌根真菌AMF菌剂(Funneliformis mosseae BGC HK01)。菌丝室中央放置一个带有密封盖、容量为330mL的有机塑料瓶，瓶朝着根室的方向开一个长方形窗口，窗口上粘一层30μm(菌丝可通过)或0.45μm(菌丝不可通过)网，形成斑块室。供试土壤采自河北省邯郸市曲周县中国农业大学长期试验站(32
°
42
′
N,114
°
54
′
E，40m)，过2mm筛，与沙子以1:1(m/m)混合作为培养基质。用剂量为25kGy的γ射线对培养基进行灭菌，以消除固有AMF及其他微生物。为保证营养供应，试验前在根室和菌丝室的培养基中均加入200mg kg
‑1N(Ca(NO3)2·
4H2O)、20mg kg
‑1P(KH2PO4)和100mg kg
‑1K(KH2PO4)。玉米种植21天后在斑块室中放置含有1％残茬的土壤，残茬为在40℃下烘干(尽量保留根内微生物)、磨碎的蚕豆根茬。并添加与培养基质所用土壤来源相同的新鲜土壤中的微生物滤液，用于平衡起始微生物群落。分别设置5个重复，于添加斑块后34天(种植玉米后55天)进行收获，收获的不同AMF处理的斑块室的新鲜土样进行反硝化细菌分离，共10个样品。每个样品取10g新鲜土样，加入到90mL无菌水中震本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株反硝化细菌，其特征在于，经鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年10月17日，保藏编号为CGMCCNO.25930。2.权利要求1所述反硝化细菌的应...

【专利技术属性】
技术研发人员：张俊伶，赵若桐，李侠，李丹丹，贝水宽，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：