一种基于CRISPR-Cas系统和荧光共振能量转移的核酸检测方法技术方案

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR
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Cas系统和荧光共振能量转移的核酸检测方法


[0001]本专利技术属于生物医学技术及应用领域，具体涉及一种基于CRISPR
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Cas系统和荧光共振能量转移的核酸检测方法。

技术介绍

[0002]生物技术作为生命科学研究的重要工具，经过几十年的发展已趋于成熟化，其中，核酸检测不仅服务于基础研究，同时在精准医疗、环境监控和公共安全等领域也具有突出的潜力和巨大的应用价值，因而其相关技术的发展备受关注。
[0003]目前，核酸检测技术主要归纳为两大类：核酸扩增的检测技术和核酸直接检测技术。链式聚合酶反应(PCR)是用于核酸扩增的最主流的方法，基于PCR衍生的定量PCR(qPCR)、数字PCR等技术因具有高灵敏度和高特异性在几乎所有研究、检测中被广泛普及。然而，昂贵的热循环设备和复杂的引物设计等缺陷使得基于PCR的核酸方法无法满足实地检测、基层医疗等需求。近几年发展起来的多种等温扩增技术被应用于核酸检测中，如环介导等温扩增技术(LAMP)、滚环扩增(RCA)、解旋酶依赖扩增(HDA)等，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR
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Cas系统和荧光共振能量转移的核酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1)选取介导核酸指导的核酸酶系统蛋白的两个氨基酸位点分别进行荧光供体A和荧光受体B的标记，得到被标记介导核酸指导的核酸酶系统蛋白，设定荧光于荧光供体A激发波长处激发，记录荧光供体A和荧光受体B的荧光值，分别记为A
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CF1和B
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CF1；所述荧光供体A的发射光谱与荧光受体B的吸收光谱重叠；2)制备介导核酸
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被标记介导核酸指导的核酸酶系统蛋白复合物，设定荧光于荧光供体A激发波长处激发，记录荧光供体A和荧光受体B的荧光值，分别记为A
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CF2和B
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CF2；所述介导核酸包含一段与靶核酸的部分序列完全互补的片段；3)将待检测样品核酸加入到上述复合物的反应体系中，设定荧光于荧光供体A激发波长处激发，记录荧光供体A和荧光受体B的荧光值，分别记为A
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EF和B
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EF；当A
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EF＜A
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CF2＜A
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CF1，B
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EF＞B
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CF2＞B
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CF1时，表明待检测样品中存在靶核酸；根据荧光值对待检测样品核酸中的靶核酸进行定量。2.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述介导核酸为RNA或DNA；所述靶核酸为RNA或DNA；优选地，所述介导核酸包含一段与靶核酸的部分序列完全互补片段的长度为16
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35nt。3.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述荧光供体A和荧光受体B为小分子对，Cy3
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Cy5；或所述荧光供体A和荧光受体B为荧光分子
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荧光淬灭基团；优选地，所述荧光分子
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荧光淬灭基团选自Coumarin
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Dabcyl、Eadns
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Dabcyl，FAM
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Dabcyl、TET
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Dabcyl或FAM
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TAMARA中的一对；优选地，所述荧光供体A和荧光受体B为荧光分子
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荧光淬灭基团时，所述被标记介导核酸指导的核酸酶系统蛋白的制备方法为：荧光分子和荧光淬灭基团先与马来酰亚胺共价结合，再通过马来酰亚胺与介导核酸指导的核酸酶系统蛋白进行反应标记，获得被标记介导核酸指导的核酸酶系统蛋白。4.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述介导核酸指导的核酸酶系统蛋白为CRISPR/Cas系统效应蛋白或其他具有类似作用的蛋白；所述CRISPR/Cas系统效应蛋白选自Cas3、Cas9、Cpf1、C2c2、C2c1和C2c中的任意一个；优选地，当所述靶核酸为DNA时，所述介导核酸指导的核酸酶系统蛋白选自CRISPR/Cas系统效应蛋白中被改造后的II型CRISPR
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Cas系统的效应蛋白Cas9或V型效应蛋白Cpf1；当所述靶核酸为RNA时，所述介导核酸指导的核酸酶系统蛋白选自CRISPR/Cas系统效应蛋白中被改造后的VI型效应蛋白C2c2；优选地，当所述靶核酸为DNA时，所述介导核酸指导的核酸酶系统蛋白为Cas9；优选地，对Cas9螺旋结构域3的S355和HNH核酸酶结构域的S867位点分别进行荧光供体A和荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：周文华，喻学锋，张琼珶，高钟，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：