本发明专利技术提供了基于中温Argonaute蛋白和等温扩增的核酸检测方法。具体地，本发明专利技术提供了一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，该体系包含：(a)向导ssDNA对或向导ssRNA对；(b)中温Argonaute蛋白(Ago酶)，所述中温Argonaute蛋白(Ago酶)为以DNA或RNA为向导指导剪切靶标DNA或靶标RNA的中温Argonaute蛋白(Ago酶)；(c)荧光报告核酸，所述荧光报告核酸带有荧光基团和淬灭基团；(d)用于等温扩增反应的试剂；其中，所述的靶标核酸分子为目标核酸。本发明专利技术方法可以广泛应用于感染性疾病如重大传染性和病原体感染性疾病(病毒、病原菌)检测领域等领域。领域。
【技术实现步骤摘要】
基于中温Argonaute蛋白和等温扩增的核酸检测方法
[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于中温Argonaute蛋白和等温扩增的核酸检测方法。
技术介绍
[0002]核酸检测是病原体检测、基因分型、病程监测的重要手段。被广泛应用于分子医学诊断、食品安全检测以及环境监测等诸多领域。
[0003]目前检测病毒核酸最为有效的方法是qPCR，该方法也是目前检测病毒核酸的金标准。但其需要专业而昂贵的仪器，对引物和探针的设计要求严格等缺点，使其不能成为便携式、家庭式的检测方法。
[0004]近年来，等温扩增技术在核酸检测领域得到了长足的发展。等温扩增技术不仅具有快速、高效、特异的优点，而且无需专用的设备。常见的恒温核酸扩增技术如环介导等温扩增技术(LAMP)、恒温指数扩增反应(EXPAR)等现已与下游检测技术相结合，发展新型核酸检测技术。然而，大多数现有技术在性能指标(如敏感性和特异性)方面都有折中。
[0005]可编程性核酸结合蛋白因其可靶向定位于不同的基因序列，并能对目的序列进行特异性的结合和切割的特点，使得核酸检测技术的特异性进一步提高。 CRISPR/Cas系统的核酸检测技术方兴未艾，而基于Argonaute蛋白的核酸检测技术因其不受靶标序列的限制且易实现一酶多重检测，目前正如火如荼地开发和应用。
[0006]基于中温原核Argonaute蛋白和逆转录酶的核酸检测方法已经被开发出来，但由于其不能够大量扩增病毒核酸，因此灵敏度不高。目前对于数量极其微少的待检测核酸核酸，发展灵敏度高、特异性好的核酸检测方法仍被迫切需要。
技术实现思路
[0007]本专利技术的目的就是提供一种对于数量极其微少的待检测核酸核酸，发展灵敏度高、特异性好的核酸检测方法。
[0008]在本专利技术的第一方面，提供了一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，该体系包含：
[0009](a)向导ssDNA对或向导ssRNA对；
[0010](b)中温Argonaute蛋白(Ago酶)，所述中温Argonaute蛋白(Ago酶)为以 DNA或RNA为向导指导剪切靶标DNA或靶标RNA的中温Argonaute蛋白(Ago 酶)；
[0011](c)荧光报告核酸，所述荧光报告核酸带有荧光基团和淬灭基团；
[0012](d)用于等温扩增反应的试剂；
[0013]其中，所述的靶标核酸分子为目标核酸。
[0014]在另一优选例中，所述中温Argonaute蛋白(Ago酶)为以DNA为向导指导剪切靶标DNA中温Argonaute蛋白(Ago酶)。
[0015]在另一优选例中，所述中温Argonaute蛋白(Ago酶)为以RNA为向导指导剪切靶标
RNA的中温Argonaute蛋白(Ago酶)。
[0016]在另一优选例中，所述等温扩增反应包括(反转录)扩增消化反应或(反转录)转录反应。
[0017]在另一优选例中，所述等温扩增包括RT
‑
RAA、NASBA、RT
‑
RPA。
[0018]在另一优选例中，所述目标核酸包括单链RNA、双链RNA、单链DNA、双链 DNA。
[0019]在另一优选例中，所述目标核酸包括来源于选自下组的目标核酸：植物、动物、微生物、病毒、或其组合。
[0020]在另一优选例中，所述目标核酸为病毒核酸或细菌16s rRNA。
[0021]在另一优选例中，所述的目标核酸是人工合成或天然存在的核酸分子。
[0022]在另一优选例中，所述的目标核酸包括野生型或突变型的核酸分子。
[0023]在另一优选例中，所述检测体系中，目标核酸经过等温扩增(消化)，所获得的靶标DNA或RNA被所述中温Argonaute蛋白(Ago酶)识别剪切。
[0024]在另一优选例中，所述靶标DNA为单链DNA。
[0025]在另一优选例中，所述靶标RNA为单链RNA。
[0026]在另一优选例中，所述中温Argonaute蛋白(Ago酶)具有以DNA为向导指导剪切靶标DNA的能力。
[0027]在另一优选例中，所述中温Argonaute蛋白(Ago酶)具有以RNA为向导指导剪切靶标RNA的能力。
[0028]在另一优选例中，所述中温Argonaute蛋白(Ago酶)选自下组：Paenibacillusborealis Argonaute(PbAgo)、Clostridium butyricum Argonaute(CbAgo)、Kurthiamassiliensis Argonaute(KmAgo)、Kluyveromyces polysporus Argonaute(KpAgo)、 Human Argonaute 2(hAgo 2)及其突变体。
[0029]在另一优选例中，所述的向导ssDNA对包括初级向导ssDNA和次级向导 ssDNA。
[0030]在另一优选例中，所述向导ssRNA包括初级向导ssRNA和次级向导ssRNA。
[0031]在另一优选例中，所述的向导ssDNA为单链DNA分子。
[0032]在另一优选例中，所述的向导ssRNA为单链RNA分子。
[0033]在另一优选例中，所述的向导ssDNA为5
’‑
磷酸化的单链DNA分子。
[0034]在另一优选例中，所述的向导ssRNA为5
’‑
磷酸化的单链RNA分子。
[0035]在另一优选例中，所述的向导ssDNA或向导ssRNA的长度为n个碱基，且n≥14。
[0036]在另一优选例中，所述的n≤100，较佳地≤80，更佳地≤60。
[0037]在另一优选例中，所述的向导ssDNA或向导ssRNA的长度为14
‑
60nt，较佳地 16
‑
40nt。
[0038]在另一优选例中，所述的初级向导ssDNAs或向导ssRNAs的数量为一对或多对。
[0039]在另一优选例中，所述次级向导ssDNAs或向导ssRNAs的数量为一条或多条。
[0040]在另一优选例中，所述的初级向导ssDNAs与靶标DNA互补配对。
[0041]在另一优选例中，所述的初级向导ssRNAs与靶标RNA互补配对。
[0042]在另一优选例中，所述的Ago酶包括野生型和突变型的Ago。
[0043]在另一优选例中，所述靶标DNA的不同分型对应的突变位点在初级向导 ssDNA的第10、11位。
[0044]在另一优选例中，所述靶标RNA的不同分型对应的突变位点在初级向导 ssRNA的第10、11位。
[0045]在另一优选例中，所述的检测体系还含有(e)镁离子溶液。
[0046]在另一优选例中，所述镁离子来自于氯化镁、硫酸镁。
[0047]在另一优选例中，所述检测体系中，镁离子的浓度为0...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，其特征在于，该体系包含：(a)向导ssDNA对或向导ssRNA对；(b)中温Argonaute蛋白(Ago酶)，所述中温Argonaute蛋白(Ago酶)为以DNA或RNA为向导指导剪切靶标DNA或靶标RNA的中温Argonaute蛋白(Ago酶)；(c)荧光报告核酸，所述荧光报告核酸带有荧光基团和淬灭基团；(d)用于等温扩增反应的试剂；其中，所述的靶标核酸分子为目标核酸。2.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述等温扩增反应包括(反转录)扩增消化反应或(反转录)转录反应。3.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述等温扩增包括RT
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RAA、NASBA、RT
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RPA。4.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述目标核酸包括单链RNA、双链RNA、单链DNA、双链DNA。5.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系中，目标核酸经过等温扩增(消化)，所获得的靶标DNA或RNA被所述中温Argonaute蛋白(Ago酶)识别剪切。6.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述中温Argonaute蛋白(Ago酶)具有以DNA为向导指导剪切靶标DNA的能力。7.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述中温Argonaute蛋白(Ag...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘倩，李晓，冯雁，孙奕杰，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：
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