一种RNA聚合酶β亚单位突变体及应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种RNA聚合酶β亚单位突变体及其应用。所述RNA聚合酶β亚单位突变体，是在野生型RNA聚合酶β亚单位(RpoC，NCBI Reference Sequences：NP_418415.1)的基础上，缺失第215位至第220位的6个氨基酸获得的，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。将其应用于生产2'

【技术实现步骤摘要】
一种RNA聚合酶
β
亚单位突变体及应用

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[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种RNA聚合酶β亚单位突变体及其应用。

技术介绍
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[0002]2'
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岩藻糖基乳糖(2'
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fucosyllactose，2'
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FL)和3
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岩藻糖基乳糖(3
‑
fucosyllactose，3
‑
FL)是母乳低聚糖(human milk oligosaccharides，HMOs)的重要成分，在调节肠道菌群、免疫力等方面发挥重要作用，具有广阔的市场前景。
[0003]目前2'
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岩藻糖基乳糖和3
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岩藻糖基乳糖的生产方法包括化学合成法、酶合成法、微生物发酵法等，其中微生物发酵法具有环境友好、成本低等优势。大肠杆菌遗传背景清晰、代谢旺盛且增殖迅速，是微生物发酵法中常用的工程菌株。大肠杆菌发酵制备各种母乳低聚糖涉及到多种酶和转运体。其中2'
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岩藻糖基乳糖和3
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岩藻糖基乳糖的生物合成路径相似。为提高2'
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岩藻糖基乳糖和3
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岩藻糖基乳糖的发酵产率，对二者生物合成路径所涉及的相关基因的编辑手段也相似(Huang D,Yang KX,Liu J,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of 2
’‑
fucosyllactose and 3
‑
fucosyllactose through modular pathway enhancement[J].Metab Eng,2017,41:23
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38；徐铮,李娜,陈盈利,等.人乳寡糖2'
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FL和3
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FL的生物制备研究进展[J].生物工程学报,2020,36(12):12.)。
[0004]本领域对2'
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岩藻糖基乳糖的从头合成途径和补救途径的关键酶、糖外排转运体等已有深入了解(Zhu,Y.Y.,et al.Recent advances on 2'
‑
fucosyllactose:physiological properties,applications,and production approaches.Critical Reviews in Food Science and Nutrition,DOI:10.1080/10408398.2020.1850413)，并通过对相关酶或转运体编码基因的基因编辑，考察了其对2'
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岩藻糖基乳糖、3
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岩藻糖基乳糖发酵产率的影响。根据报道，敲除以下基因中的一种或多种：β
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半乳糖苷酶编码基因lacZ、UDP
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葡萄糖脂质载体转移酶编码基因wcaJ、乳糖lac操纵子序列中的调节基因lacI、L
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岩藻糖异构酶编码基因fucI、L
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墨角藻糖激酶编码基因fucK、L
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墨角藻糖
‑1‑
磷酸醛缩酶编码基因fucA(Ni ZJ,et al.Multi
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Path Optimization for Efficient Production of 2
′‑
Fucosyllactose in an Engineered Escherichia coli C41(DE3)Derivative[J].Frontiers in Bioengineering and Biotechnology,2020,8)；和/或过表达以下基因的一种或多种：GDP
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岩藻糖合成酶编码基因wcaG、GDP
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甘露糖
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4,6
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脱水酶编码基因gmd、β
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半乳糖苷透性酶编码基因lacY、磷酸甘露糖异构酶编码基因manA、磷酸甘露糖变位酶编码基因manB、糖外排转运体A编码基因setA、甘露糖
‑1‑
磷酸鸟嘌呤转移酶编码基因manC、L
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阿拉伯糖异构酶编码基因araA、鼠李糖异构酶编码基因rhaA、2'
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岩藻糖基乳糖合成酶编码基因futC、L
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岩藻糖激酶/GDP
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L
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岩藻糖焦磷酸化酶编码基因fkp有利于提高2'
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岩藻糖基乳糖和3
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岩藻糖基乳糖的发酵产率。其中fucI、fucK、fucA、araA、rhaA、fkp等参与2'
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岩藻糖基乳糖的补救合成途径。由于α
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(1,3)
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岩藻糖基转移酶(FutA)的低活性和不溶性表达，与2'
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岩藻糖基乳糖相比，3
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岩藻糖基乳糖的发酵产率较低。因此，进一步过表达或插入α
‑
(1,3)
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岩藻糖基转移酶编码基因futA或对α
‑
(1,3)
‑
岩藻糖基转移酶编码基因futA进行有益突变，更有利于提高3
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岩藻糖基乳糖的发酵产率(Yun HC,Park BS,Seo J,et al.Biosynthesis of the human milk oligosaccharide 3
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fucosyllactose in metabolically engineered Escherichia coli via the salvage pathway through increasing GiP synthesis andβ
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galactosidase modification[J].Biotechnology and Bioengineering,2019.)。
[0005]目前，工业生产2'
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岩藻糖基乳糖和3
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岩藻糖基乳糖时，由于发酵环境中高浓度的2'
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岩藻糖基乳糖和3
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岩藻糖基乳糖会对菌株的生产性能造成抑制，因此菌株的环境耐受性对其高效生产来说至关重要。进一步对菌株进行改良，以提高其环境耐受性，进而提高2'
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岩藻糖基乳糖和3
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岩藻糖基乳糖产率，仍是目前需要解决的问题。
[0006]rpoC基因编码大肠杆菌RNA聚合酶β亚单位，其突变体可以通过提高部分代谢物产量，引起细胞膜的变化以及增强菌株对特殊代谢物的利用能力，进而增强菌株的环境耐受性。工业生产2'
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岩藻糖基乳糖和3
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岩藻糖基乳糖时，由于发酵环境本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RNA聚合酶β亚单位突变体，其特征在在于，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。2.权利要求1所述RNA聚合酶β亚单位突变体的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，是所述RNA聚合酶β亚单位突变体在生产2'
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岩藻糖基乳糖或3
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岩藻糖基乳糖中的应用。4.一种生产2'
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岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，所述工程菌以大肠杆菌K12MG1655为出发菌株，敲除出发菌株的乳糖lac操纵子序列中的P
lac
启动子序列及调节基因lacI和lacZ，在原lacZ位点之后以P
trc
启动子过表达wcaG、gmd和lacY基因，进而将乙醇脱氢酶编码基因adhE替换为P
trc
启动子过表达的manA和manB，之后敲除基因组上的wcaJ基因，将基因组上的RNA聚合酶β亚单位基因rpoC突变为SEQ ID NO.2所示的RNA聚合酶β亚单位突变体基因，并通过质粒pirc99a过表达futC、manC以及setA基因所得。5.一种生产3
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岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，所述工程菌以大肠杆菌K12MG1655为出发菌株，敲除出发菌株的乳糖lac操纵子序列中的P
lac
启动子序列及调节基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙雪，李庆刚，谢真真，何晋怀，宗剑飞，肖卫华，刘传，张文聪，李玉，路福平，
申请(专利权)人：山东合成远景生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：