一种利用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物构建的酶组装体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种利用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物构建的酶组装体及其制备方法和应用，本发明专利技术方法包括：将聚乙二醇马来酰亚胺衍生物与酶交联，获得酶组装体；其中：所述酶由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列单一突变所得，所述单一突变是用半胱氨酸残基的置换。本发明专利技术还涉及了由该方法构建得到的酶组装体及其应用。本发明专利技术通过简单高效的方法实现了蛋白质在特定位点的组装，成功制备了相对空间定位可控的酶组装体。采用本发明专利技术方法形成的酶组装体能够在基本不影响酶活性的基础上，进一步提高酶的热稳定性。性。性。

【技术实现步骤摘要】
一种利用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物构建的酶组装体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及酶组装领域，更具体地，本专利技术涉及一种利用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物构建的酶组装体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]相关技术中，提高酶稳定性的方法有：交联酶聚集体技术或活性包涵体技术；交联酶聚集体技术是一种用盐、有机溶剂或非离子聚合物等沉淀剂沉淀酶蛋白，得到酶聚集体，再用交联剂交联的无载体固定化方法。活性包涵体技术是指通过在酶分子的序列末端融合表达疏水或两亲性多肽，多肽之间的非特异性作用导致酶在表达过程中形成有活性的聚集体，即活性包涵体。以上两种技术都能够提高酶的稳定性，但因为其仅仅是将酶分子杂乱的聚集在一起，使得酶的聚集体的整体活性降低。
[0003]因此，如何精确设计酶组装体，使其能够在不影响酶的催化活性的基础上，提高酶的稳定性，具有较大的应用价值。目前，已经开发了许多关于蛋白质组装体的设计策略，驱动蛋白质组装的作用力主要有SpyTag
‑
SpyCatcher形成的异肽键、分选酶催化N末端聚甘氨酸和C末端LPXTG标签的连接、分裂内含肽自催化的剪接反应、结构域交换等生物方法，然而这些生物方法不仅需要大量的基因操作，还存在蛋白质的组装速率慢，组装效率较低，无法控制组装体中蛋白的相对空间定位等问题。此外，还有引入主客体相互作用、戊二醛交联、金属配位作用的化学方法，然而这些化学方法存在非共价作用特异性低，组装效率低，分离纯化复杂等缺点，阻碍了酶组装的实际应用。
[0004]公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
[0006]为此，本专利技术实施例提供了一种用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物驱动酶组装的方法，该方法包括：将聚乙二醇马来酰亚胺衍生物与酶交联，获得酶组装体；其中：
[0007]所述酶由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列单一突变所得，所述单一突变是用半胱氨酸残基的置换；
[0008]所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物含有至少两个马来酰亚胺端基。
[0009]本专利技术实施例提出了用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物驱动米曲霉来源的β
‑
葡萄糖醛酸苷酶(PGUS)(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)的自组装。通过突变引入的半胱氨酸与聚乙二醇马来酰亚胺衍生物的点击加成反应(巯基
‑
马来酰亚胺加成)，通过简单高效的方法实现了蛋白质在特定位点的组装，成功制备了相对空间定位可控的酶组装体。采用本专利技术方法形成的酶组装体能够在基本不影响酶活性的基础上，进一步提高酶的热稳定性。
[0010]优选地，所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物含有两个或四个马来酰亚胺端基。
[0011]所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物的结构式为：PEG
‑
X
‑
MAL；其中，
[0012]PEG为聚乙二醇残基，MAL为马来酰亚胺基；
[0013]X为PEG与MAL的连接基团，选自：
‑
(CH2)
r
‑
、
‑
(CH2)
r
O
‑
、
‑
(CH2)
r
CO
‑
、
‑
(CH2)
r
NH
‑
、
‑
(CH2)
r
CONH
‑
、
‑
(CH2)
r
NHCO
‑
、
‑
(CH2)
r
S
‑
、
‑
(CH2)
r
COO
‑
和
‑
(CH2)
r
OCO
‑
中一种或两种以上的组合，r为0
‑
10的整数。优选地，r为0
‑
5的整数。
[0014]在一些实施例中，所述PEG为直链聚乙二醇残基、四臂支链聚乙二醇残基、六臂支链聚乙二醇残基中的一种。
[0015]在一些实施例中，所述单一突变为以下任意一种：
[0016](1)28位天冬酰胺(Asn)突变为半胱氨酸(Cys)；
[0017](2)34位的苏氨酸(Thr)突变为半胱氨酸(Cys)；
[0018](3)100位的天冬酰胺(Asn)突变为半胱氨酸(Cys)；
[0019](4)180位的谷氨酰胺(Gln)突变为半胱氨酸(Cys)；
[0020](5)194位的甘氨酸(Gly)突变为半胱氨酸(Cys)；
[0021](6)220位的天冬氨酸(Asp)突变为半胱氨酸(Cys)；
[0022]优选地，所述单一突变为以下任意一种：
[0023]28位天冬酰胺(Asn)突变为半胱氨酸(Cys)，或者是
[0024]194位的甘氨酸(Gly)突变为半胱氨酸(Cys)，或者是
[0025]180位的谷氨酰胺(Gln)突变为半胱氨酸(Cys)。
[0026]更优选地，所述单一突变为194位的甘氨酸(Gly)突变为半胱氨酸(Cys)。
[0027]在一些实施例中，所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物为双臂聚乙二醇马来酰亚胺(Mal2)，或四臂聚乙二醇马来酰亚胺(Mal4)。优选为：四臂聚乙二醇马来酰亚胺，四臂聚乙二醇马来酰亚胺与双臂聚乙二醇马来酰亚胺相比而言，可以进一步提高酶自组装效率。
[0028]在一些实施例中，所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物的分子量为2000
‑
3400Da。
[0029]在一些实施例中，所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物与酶的摩尔比为1:(1.5
‑
2.5)，优选地，摩尔比为1：2。
[0030]在一些实施例中，所述交联的条件为：pH值为6.8
‑
7.4，反应温度为0
‑
10℃，反应时间为2
‑
12小时。
[0031]本专利技术实施例还提供了由上述方法制备得到的酶组装体。本专利技术实施例制备的酶组装体具有催化活性高、热稳定性高、反应条件温和，高效，绿色安全等优点。
[0032]本专利技术实施例还提供了上述酶组装体在转化甘草酸生成甘草次酸中的应用。
[0033]本专利技术具有如下优点和有益效果：
[0034](1)本专利技术用聚乙二醇马来酰亚胺交联剂驱动米曲霉来源的β
‑
葡萄糖醛酸苷酶(PGUS)(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)的自组装。通过突变引入的半胱氨酸与聚乙二醇马来酰亚胺衍生物(交联剂)的点击加成反应(巯基
‑
马来酰亚本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物驱动酶组装的方法，其特征在于，该方法包括：将聚乙二醇马来酰亚胺衍生物与酶交联，获得酶组装体；其中：所述酶由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列单一突变所得，所述单一突变是用半胱氨酸残基的置换；所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物含有至少两个马来酰亚胺端基。2.根据权利要求1所述一种用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物驱动酶组装的方法，其特征在于，所述单一突变为以下任意一种：(1)28位天冬酰胺突变为半胱氨酸；(2)34位的苏氨酸突变为半胱氨酸；(3)100位的天冬酰胺突变为半胱氨酸；(4)180位的谷氨酰胺突变为半胱氨酸；(5)194位的甘氨酸突变为半胱氨酸；(6)220位的天冬氨酸突变为半胱氨酸。3.根据权利要求2所述一种用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物驱动酶组装的方法，其特征在于，所述单一突变为以下任意一种：28位天冬酰胺突变为半胱氨酸，或者是194位的甘氨酸突变为半胱氨酸，或者是180位的谷氨酰胺突变为半胱氨酸。4.根据权利要求1所述一种用聚乙二醇马来酰亚胺衍生物驱动酶组装的方法，其特征在于，所述聚乙二醇马来酰亚胺衍生物的结构式为：PEG
‑
X
‑
MAL；其中，PEG为聚乙二醇残基，MAL为马来酰亚胺基；X为PEG与MAL的连接基团，选自：
‑
(CH2)
r
‑
、
‑
(CH2)
r
O
‑
、
‑
(CH2)
r
CO
‑
、
‑
(CH2)
r
NH
‑
、
‑
(CH2)
r
C...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘护，王启彬，李春，冯旭东，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：