一种血清中胆汁酸的检测方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体涉及一种血清中胆汁酸的检测方法。本发明专利技术采用的检测方法可以实现多种胆汁酸及其同分异构体高效的色谱分离，分离效果好，同时采用同位素内标法，定量分析结果准确。本发明专利技术采用的检测方法可以避免不同采血管中凝血剂种类不同对胆汁酸测定结果的影响。本发明专利技术采用平行液相色谱仪串联质谱仪技术，充分利用样品洗脱和清洗平衡时间，有效缩短检测时间，提高样品分析通量及检测效率。检测效率。检测效率。

【技术实现步骤摘要】
一种血清中胆汁酸的检测方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种血清中胆汁酸的检测方法。

技术介绍

[0002]胆汁酸是在肝脏中由胆固醇合成的一类两性甾醇类化合物，是胆汁的重要成分，在调节机体脂肪代谢上发挥重要作用。健康人体中，胆汁酸谱组分相对恒定，发生胆石症、动脉粥样硬化、高血压等多种疾病时，会引起人体胆汁酸代谢异常，导致胆汁酸含量发生改变，建立稳定可靠的胆汁酸检验方法，可以了解机体胆汁酸的代谢，有助于为疾病的诊断和治疗提供可靠的依据。目前临床上主要以血清总胆汁酸浓度作为急慢性肝炎、肝硬化以及妊娠期肝内胆汁淤积症等肝脏疾病的诊断指标，在国内医疗机构中将胆汁酸分型检测技术作为常规检测项目的开展尚不成熟。总胆汁酸浓度检测虽然简便快捷，但检测结果对疾病的诊断及治疗的指导作用有限，对于某些疾病进程的诊断，个别胆汁酸浓度的变化往往具有更高的诊断灵敏度。因此，检测每一种胆汁酸的体内水平而非简单地定量总胆汁酸含量，对于肝胆和肠道疾病的筛查、诊断和鉴别诊断具有重要价值。
[0003]由于胆汁酸种类繁多，不同种类之间理化性质差别较大，而相同种类仅存在微小的结构差异，且含量在生物体内差异较大，因此同时测定多种不同种类的胆汁酸存在一定的困难。胆汁酸检测方法主要包括光谱分析法、酶联免疫法以及液相色谱串联质谱法等。光谱分析法灵敏度低，需要衍生化处理，操作复杂且容易受到基质干扰的影响；酶联免疫法特异性强，通量低，方法灵敏度低且易受基质干扰的影响；液相色谱串联质谱法是目前覆盖度最广的检测方法，但是，胆汁酸同分异构体众多，色谱分离难度较大，部分指标容易受到同分异构体的干扰，导致结果存在偏差。此外，血清中胆汁酸检测前处理操作步骤复杂，且液相色谱串联质谱同时检测15种胆汁酸的分析时间较长，一般在30min左右，限制其在临床实验室高通量的检出应用。

技术实现思路

[0004]针对上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种血清中胆汁酸的检测方法，从而实现血清中多种胆汁酸及其同分异构体化合物的高效色谱分离，抗干扰能力强，有效缩短样本检测分析时间，提高分析通量及检测效率。
[0005]为实现上述专利技术目的，本专利技术通过以下技术方案实现：一种血清中胆汁酸的检测方法，包括如下步骤：(S.1)胆汁酸标准曲线储备液、系列混合标准曲线工作液及校准品溶液的制备；(S.2)胆汁酸质控储备液、混合质控工作液及质控样品工作液的制备；(S.3)内标储备液及内标工作液的制备；(S.4)血清样本的前处理；(S.5)样本检测利用液相色谱串联质谱仪对步骤(S.1)中的待测目标胆汁酸的校准品溶液进行检
测，采用内标法拟合得到目标胆汁酸的标准曲线；利用液相色谱串联质谱仪对步骤(S.2)中的质控样品工作液进行检测，利用目标胆汁酸的标准曲线计算得到质控样品浓度和回收率，从而验证目标胆汁酸的标准曲线的准确性；取步骤(S.4)中经过前处理后的待测样品进行液相色谱串联质谱检测，将所得待测样品的检测曲线与目标胆汁酸的标准曲线进行比对，从而判断待测样品中胆汁酸的种类并计算出相对应的含量。
[0006]为了保护体外检验用血液和血浆，向采血管中加入抗凝剂和保护剂几乎是不可避免的事，但是它们的加入会对血液样品造成影响，容易干扰对其的定量检测分析。目前市场上出售的采血管不下十多种，如分离胶促凝血清管、肝素锂抗凝管、EDTA
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K2抗凝管、EDTA
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Na2抗凝管等。目前分离胶试管已经广泛应用到临床生化、免疫、药物浓度分析项目的测定中。肝素锂抗凝管能快速分离血浆，被普遍用在急诊生化检验中。而分离胶促凝血清管当中的胶体本身和促凝剂、肝素锂抗凝管中的肝素锂等在临床生化项目及免疫项目检测中都会影响化合物定量检测。此外，一般在抗凝真空采血管的添加物中，除了加入抗凝剂外，还会再加入一些添加剂涂在采血管的内壁当中，防止血液在采集过程中挂壁的情况，方便让血液更加通畅流入到采血管中，减少溶血。然而在最近几年的研究中发现，添加表面活性剂之后，常常会对检验结果产生影响。
[0007]本专利技术人无意中发现，通过设定特定的液相梯度洗脱程序和清洗平衡程序，可以有效避免不同采血管中不同种类的凝血剂对胆汁酸测定结果的影响。原因在于胆汁酸会跟采血管中的凝血剂产生检测干扰。而液相色谱法的分离原理是：溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小以及强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。因此，通过设置特定的液相梯度洗脱程序和清洗平衡程序并结合特定的色谱柱，可以让胆汁酸及其同分异构体和不同种类凝血剂干扰物在色谱柱上实现不一样的吸附分配作用。继而导致胆汁酸及其同分异构体和不同种类凝血剂干扰物流出的时间不一样，从而实现分离。另外，质谱多反应监测模式(MRM模式)是一种基于已知或假定的反应离子信息，有针对性地选择数据进行质谱信号采集，对符合规则的离子信号进行记录，去除不符合规则离子信号的干扰，通过对数据的统计分析从而获取质谱质量信息的质谱技术。设定特定的液相梯度洗脱程序和清洗平衡程序结合质谱多反应监测模式，可以有效增强对目标胆汁酸的识别，减少干扰。
[0008]作为优选，所述步骤(S.5)中液相采用梯度洗脱和清洗平衡，所述梯度洗脱程序如下：以0～13min，流动相A从50～70％线性变化至10～20％，流动相B从30～50％线性变化至80～90％，13～17min，流动相A从10～20％线性变化至50～70％，流动相B从80～90％线性变化至30～50％进行梯度洗脱；所述清洗平衡程序如下：0～17min，以50～70％的流动相A，30～50％的流动相B进行清洗平衡。
[0009]作为进一步优选，所述步骤(S.5)中液相采用梯度洗脱和清洗平衡，所述梯度洗脱程序如下：以0～9min，流动相A从50％线性变化至20％，流动相B从50％线性变化至80％，9～10min，流动相A从20％线性变化至50％，流动相B从80％线性变化至50％进行梯度洗脱；
所述清洗平衡程序如下：0～10min，以50％的流动相A，50％的流动相B进行清洗平衡。
[0010]作为优选，所述液相中的流动相A为质量浓度5～15％的甲酸水溶液；液相中的流动相B为含有乙腈和甲醇的混合溶剂，所述混合溶剂中乙腈和甲醇的体积比为1:1～5:1。
[0011]作为进一步优选，所述液相中的流动相A为质量浓度10％的甲酸水溶液；液相中的流动相B为含有乙腈和甲醇的混合溶剂，所述混合溶剂中乙腈和甲醇的体积比为3:1。
[0012]作为优选，所述步骤(S.5)中液相色谱采样采用至少两台液相进行双样品交替分析，任一平行液相分析的同时另一平行液相清洗平衡，从而实现连续数据采集。
[0013]作为进一步优选，所述步骤(S.5)中液相色谱采样采用两台液相进行双样品交替分析。其中一台平行液相分析的同时另一台平行液相清洗平衡，继而当其中一台平行液相完成数据采集时，另一台平行液相立即开始采集数据，从而实现连续数据采集。
[0014]通本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血清中胆汁酸的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(S.1)胆汁酸标准曲线储备液、系列混合标准曲线工作液及校准品溶液的制备；(S.2)胆汁酸质控储备液、混合质控工作液及质控样品工作液的制备；(S.3)内标储备液及内标工作液的制备；(S.4)血清样本的前处理；(S.5)样本检测利用液相色谱串联质谱仪对步骤(S.1)中的待测目标胆汁酸的校准品溶液进行检测，采用内标法拟合得到目标胆汁酸的标准曲线；利用液相色谱串联质谱仪对步骤(S.2)中的质控样品工作液进行检测，利用目标胆汁酸的标准曲线计算得到质控样品浓度和回收率，从而验证目标胆汁酸的标准曲线的准确性；取步骤(S.4)中经过前处理后的待测样品进行液相色谱串联质谱检测，将所得待测样品的检测曲线与目标胆汁酸的标准曲线进行比对，从而判断待测样品中胆汁酸的种类并计算出相对应的含量。2.根据权利要求1所述的一种血清中胆汁酸的检测方法，其特征在于，所述步骤(S.5)中液相采用梯度洗脱和清洗平衡，所述梯度洗脱程序如下：以0～13min，流动相A从50～70％线性变化至10～20％，流动相B从30～50％线性变化至80～90％，13～17min，流动相A从10～20％线性变化至50～70％，流动相B从80～90％线性变化至30～50％进行梯度洗脱；所述清洗平衡程序如下：0～17min，以50～70％的流动相A，30～50％的流动相B进行清洗平衡。3.根据权利要求2所述的一种血清中胆汁酸的检测方法，其特征在于，所述液相中的流动相A为质量浓度5～15％的甲酸水溶液；液相中的流动相B为含有乙腈和甲醇的混合溶剂，所述混合溶剂中乙腈和甲醇的体积比为1:1～5:1。4.根据权利要求1所述的一种血清中胆汁酸的检测方法，其特征在于，所述步骤(S.5)中液相色谱采样采用至少两台液相进行双样品交替分析，任一平行液相分析的同时另一平行液相清洗平衡，从而实现连续数据采集。5.根据权利要求1所述的一种血清中胆汁酸的检测方法，其特征在于，所述步骤(S.5)中液相色谱条件为：采用胆汁酸C18色谱柱(3.0mm
×
50mm
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5μm)，流动相流速为0.3～0.5mL/min，柱温为35～50℃。6.根据权利要求1所述的一种血清中胆汁酸的检测方法，其特征在于，所述步骤(S.5)中质谱条件为：在电喷雾离子源负离子模式下，采用多反应监测扫描模式进行扫描...

【专利技术属性】
技术研发人员：周衍霄，裴海燕，鄢茜，杨继伟，俞晓峰，
申请(专利权)人：杭州谱聚医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：