一种复合富硒微生物菌剂及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种复合富硒微生物菌剂及其制备方法。制备方法为将四种富集培养物发酵液分别与稻壳粉混合搅拌制成菌剂，再将有机质降解菌剂、富硒菌剂、辅助菌剂按照一定比例进行混合配制成复合富硒微生物菌剂。本发明专利技术避免了单一功能菌只将难利用的硒转化为纳米硒，而是通过有机质降解菌、硫酸盐还原菌、硒酸盐还原及固氮菌的共同作用，从多个途径将难利用的硒形态向可利用形态的硒转化(能够有效促进土壤中水溶态硒、离子交换态硒和碳酸盐结合态硒等有效硒的提升，并显著降低土壤中的有机结合态和腐殖酸结合态硒)；提高土壤中硒的有效利用率的角度提升作物的富硒效果，能够充分的利用土壤中的硒资源，提高作物的富硒效果，显著提升植株的硒含量。提升植株的硒含量。提升植株的硒含量。

【技术实现步骤摘要】
一种复合富硒微生物菌剂及其制备方法


[0001]本专利技术涉及农用微生物与土壤修复
，尤其涉及一种复合富硒微生物菌剂及其制备方法。

技术介绍

[0002]硒(Se)是人体必需的微量元素之一，是多种酶和蛋白质的重要组成成分，具有抗氧化、解毒、抗癌、增强免疫等功效，对人体健康具有十分重要的意义。土壤中的硒包括有水溶态、离子交换态、碳酸盐结合态、腐殖酸结合态、铁锰结合态、强有机结合态和残渣态七种，其中水溶态和离子交换态和碳酸盐结合态硒容易被作物所吸收，其他形态难以或者无法被作物所吸收，导致硒资源的浪费。
[0003]现有的富硒菌剂往往存在微生物菌种单一，功能不稳定等问题，大量的菌种资源亟待开发。本专利技术将单一富硒菌剂按照不同比例进行复配，发挥多种菌剂的协同作用，改善了单一富硒菌剂富硒效率低、有效态硒转化量低等问题，起到了更好的促进植物富硒的效果。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种复合富硒微生物菌剂及其制备方法。
[0005]本专利技术的一种复合富硒微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
[0006]S1：富集有机质降解菌富集培养物、硒酸盐/亚硒酸盐还原菌富集培养物、固氮菌富集培养物、硫酸盐还原菌富集培养物备用；
[0007]S2：分别活化上述四种富集培养物，制备四种富集培养物发酵液；
[0008]S3：将有机质降解菌富集培养物发酵液与稻壳粉混合搅拌制成有机质降解菌剂，将硒酸盐/亚硒酸盐还原菌富集培养物发酵液与稻壳粉混合搅拌制成富硒菌剂，将固氮菌富集培养物发酵液与硫酸盐还原菌富集培养物发酵液进行混合后制成辅助菌混合菌液，再将混合菌液与稻壳粉混合搅拌制成辅助菌剂；
[0009]S4：将有机质降解菌剂、富硒菌剂、辅助菌剂按照一定比例进行混合配制成复合富硒微生物菌剂；
[0010]步骤S1中的具体过程如下：取来源于富硒地区的新鲜土壤于无菌水中震荡，静置后固液分离，取上清液分别接种到1/10TSB培养基、硫酸盐还原菌培养基、固氮菌培养基中培养后，再将稀释后菌液均匀涂布到固体1/10TSB培养基、硫酸盐还原菌培养基、固氮菌培养基中恒温培养，挑取平板中菌落置于液体1/10TSB培养基、硫酸盐还原菌培养基、固氮菌培养基中培养至指数生长期，将其分别保存于甘油中，作为硒酸盐/亚硒酸盐还原菌富集培养物、硫酸盐还原菌富集培养物、固氮菌富集培养物；
[0011]取高有机质含量地区的新鲜土壤于无菌水中震荡，静置后固液分离，取上清液接种到LB培养基中培养后，再将稀释后菌液均匀涂布到固体LB培养基恒温培养，挑取平板中
菌落置于液体LB培养基中培养至指数生长期，将其保存于甘油中，作为有机质降解菌富集产物；
[0012]进一步的，步骤S2的具体过程如下：配制牛肉膏蛋白胨培养基，将四种富集培养物同时按照1％的比例分别接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，培养达到对数生长后期，离心收集菌体，添加生理盐水制成富集培养物发酵液。
[0013]进一步的，所述有机质降解菌富集培养物发酵液、硒酸盐/亚硒酸盐还原菌富集培养物发酵液、辅助菌混合菌液与稻壳粉的质量比均为2:1。
[0014]进一步的，辅助菌混合菌液中，固氮菌富集培养物发酵液与硫酸盐还原菌富集培养物发酵液的体积比为1：1。
[0015]进一步的，有机质降解菌剂、富硒菌剂和辅助菌剂以质量比1:1:1配制成复合富硒微生物菌剂。
[0016]进一步的，硒酸盐/亚硒酸盐还原菌富集培养物发酵液包括生根瘤菌、不动杆菌、从毛单胞菌和芽孢杆菌。
[0017]进一步的，硫酸盐还原菌富集培养物发酵液包括布丘氏菌、丙酸螺菌、埃希氏菌、土孢杆菌和梭菌。
[0018]进一步的，固氮菌富集培养物发酵液包括假单胞菌、根瘤菌、气单胞菌、甲苯单胞菌、布丘氏菌和管道杆菌。
[0019]进一步的，有机质降解菌富集培养物发酵液包括芽孢杆菌、肠杆菌和赖氨酸芽孢杆菌。
[0020]采用上述的制备方法制备的复合富硒微生物菌剂。
[0021]本专利技术所选取的菌种为前期经过分离鉴定具有促进植物富硒效果的菌种，分别为：有机质降解菌富集培养物、硒酸盐/亚硒酸盐还原菌富集培养物、硫酸盐还原菌富集培养物和固氮菌富集培养物。四个菌富集产物从多个途径将难利用的硒形态向可利用形态的硒转化，具体途径如下：
[0022](1)硒酸盐/亚硒酸盐还原菌：硒酸盐/亚硒酸盐对硒具有直接转化作用，能够将Se(Ⅳ)和Se(
Ⅵ
)转化为纳米硒，将被吸附的无机硒转化为生物可利用性高的纳米硒，从而提高土壤硒的有效性；
[0023](2)有机质降解菌：在土壤中，有机质对硒的强烈吸附作用使硒的有效性降低，有机质降解菌将大分子的有机质分解成小分子，释放被吸附的硒，同时有机质的分解增加了土壤的肥力，促进作物的生长，使作物吸收更多的硒；
[0024](3)硫酸盐还原菌：硫酸还原菌具有Se(Ⅳ)还原的功能，一方面，硫酸盐还原菌能够利用胞内的硫酸盐还原酶将Se(Ⅳ)还原成纳米硒，另一方面，硫酸盐还原菌还原硫酸盐会产物H2S，H2S在胞外能够将Se(Ⅳ)还原成纳米硒，从而提高硒的有效性；
[0025](4)固氮菌：固氮菌对硒的转化体现在直接转化和间接转化两个方面：
①
固氮菌胞内能够产生黄素蛋白，然后通过黄素蛋白将Se(Ⅳ)还原成纳米硒，从而提高硒的生物有效性。
②
微生物能够将空气中的氮气固定为氨，为作物的生长提供养分，促进植物的生长和对土壤中硒的吸收，从而提高作物的富硒效果。
[0026]本专利技术分别制备了多个不同比例的复合微生物菌剂，形成多组对照，于盆栽及大田试验中均取得较好的富硒效果，最终得出最佳比例(有机质降解菌剂：富硒菌剂：辅助菌
1.0g，Na2SO
4 1.0g，CaSO4·
2H2O 0.1g，MgSO4·
7H2O 2.0g，乳酸钠20mmol，Yeast extract 1.0g，溶于1L的超纯水，添加1％的还原剂(10g/L抗坏血酸+10g/L巯基乙酸钠)和1％的硫酸亚铁铵。用高纯氮进行除氧，加盖胶塞和铝盖，121℃灭菌30min备用。)进行富集，得到目的富集产物。然后将其置于20％甘油中保存，于
‑
80℃冰箱中贮存，用于后续研究。
[0046](3)固氮菌的富集：使用固氮菌培养基(Burk培养基)：称取KH2PO40.2g，K2HPO
4 0.8g，MgSO4·
7H2O 0.2g，CaSO4·
2H2O 0.1g，甘露醇20g，溶于1L的超纯水。再加入20μL的1％的FeCl3溶液和Na2Mo4·
2H2O溶液，调节pH值至7.0，121℃灭菌30min备用。
[0047](4)有机质降解菌的富集：本专利技术使用的有机质降解菌使用LB培养基进行富集：Tryptone 10g，Yeast extract 10g，NaCl 5g，溶于1L的超纯水，12本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种复合富硒微生物菌剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：S1：富集有机质降解菌富集培养物、硒酸盐/亚硒酸盐还原菌富集培养物、固氮菌富集培养物、硫酸盐还原菌富集培养物备用；S2：分别活化上述四种富集培养物，制备四种富集培养物发酵液；S3：将有机质降解菌富集培养物发酵液与稻壳粉混合搅拌制成有机质降解菌剂，将硒酸盐/亚硒酸盐还原菌富集培养物发酵液与稻壳粉混合搅拌制成富硒菌剂，将固氮菌富集培养物发酵液与硫酸盐还原菌富集培养物发酵液进行混合后制成辅助菌混合菌液，再将混合菌液与稻壳粉混合搅拌制成辅助菌剂；S4：将有机质降解菌剂、富硒菌剂、辅助菌剂按照一定比例进行混合配制成复合富硒微生物菌剂；步骤S1中的具体过程如下：取来源于富硒地区的新鲜土壤于无菌水中震荡，静置后固液分离，取上清液分别接种到1/10TSB培养基、硫酸盐还原菌培养基、固氮菌培养基中培养后，再将稀释后菌液均匀涂布到固体1/10TSB培养基、硫酸盐还原菌培养基、固氮菌培养基中恒温培养，挑取平板中菌落置于液体1/10TSB培养基、硫酸盐还原菌培养基、固氮菌培养基中培养至指数生长期，将其分别保存于甘油中，作为硒酸盐/亚硒酸盐还原菌富集培养物、硫酸盐还原菌富集培养物、固氮菌富集培养物；取高有机质含量地区的新鲜土壤于无菌水中震荡，静置后固液分离，取上清液接种到LB培养基中培养后，再将稀释后菌液均匀涂布到固体LB培养基恒温培养，挑取平板中菌落置于液体LB培养基中培养至指数生长期，将其保存于甘油中，作为有机质降解菌富集产物。2.如权利要求1所述的一种复合富硒微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：张艺博，李平，殷汉琴，黄春雷，邵一先，黄显鑫，余岳，
申请(专利权)人：浙江省地质调查院，
类型：发明
国别省市：