一种同时检测牛奶中多种酞酸酯的液质联用（ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ）测定方法，属于食品检测技术领域。本发明专利技术牛奶样品用乙腈和氯化钠直接提取；液相色谱分离采用甲酸醋酸铵水溶液－甲醇体系作为流动相，梯度洗脱；质谱检测器检测，采用外标法以峰面积法进行定量检测。本发明专利技术方法灵敏度高、准确度和精密度好，专属性及确证性可靠，而且非常简便并可易于实际检测应用，且可非常好地满足实际检测中的需要。
【技术实现步骤摘要】
一种同时检测牛奶中多种酞酸酯的液质联用(LC-ESI-MS/MS)测定方法， 具体是一种可同时对牛奶中9种酞酸酯进行定量测定的LC- ESI-MS/MS方法， 属于食品检测
技术介绍
酞酸酯类化合物(Phthalatic acid esters, PAEs)，多为无色油状粘稠液体， 易溶于脂肪和有机溶剂，难溶于水，不易挥发，含有较弱的雌激素成分，影响 生物体内分泌、导致突变、致畸和癌细胞增殖，是一类环境激素。可通过呼吸、 饮食和皮肤接触进入人体内，对人体健康造成危害。PAEs不仅具有一般毒性， 还具有特殊毒性，如生殖毒性、胚胎毒性和遗传毒性等。PAEs是塑料工业的主 要增塑剂和软化剂，主要用于生产橡胶、塑料、润滑剂、粘合剂、涂料、高分 子助剂、印刷油墨用软化剂及电容器油等，由于它们的兼容性和软化能力，尤 其广泛地应用在软质的聚氯乙烯(PVC)产品中。PAEs可广泛应用于食品包装材 料、容器、医疗用品及人造革等的制造，还可用作农药载体，驱虫剂、化妆品 和香料的调配剂，以及涂料和润滑剂的成分。由于PAEs与塑料基质之间没有形 成化学键，而是以氢键和范德华力连接，接触到合适的有机溶剂便会溶解出来， 对环境、生物和食品造成污染。PAEs在全球主要工业国的生态环境中已达到了普遍检出的程度。PAEs对环 境的污染已经受到世界各国的普遍重视。其中DMP(邻苯二甲酸二甲酯)，DEP(二 乙酯)，DBP (二丁酯)，BBP (丁基卞基酯)，DNOP (二正辛酯)，DEHP (二-( 2-乙 基己基)酯)等已被美国环保局(EPA)列为首选检测污染物。欧盟的1999/815/EU 指令也规定儿童用PVC玩具中含有的DBP， BBP， DEHP， DNOP, DINP (二 异壬酯)，DIDP(二异癸酯)等6种对人体和环境有害的物质，其总检出量必须低 于0.1%。由于PAEs在环境中残留期较长，生物对其具有富集作用，我国也己 将PAEs族系中的邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)和邻苯 二甲酸二正辛酯(DNOP)确定为环境优先控制的污染物。目前有关酞酸酯类化合物的检测报道在环境方面比较多，涉及食品方面的 相对较少。大多数食品均采用塑料制品进行内包装或内衬。邻苯二甲酸酯类化 合物能从塑料包装袋中向食品、特别是含油脂食品，如牛奶、肉类中迁移，食 品在塑料包装材料中储存的时间越长，或用于包装食品的塑料材料中增塑剂含 量越高，都会加大增塑剂向食品中迁移的量，即对食品的污染程度越大。国内在1984年后才陆续出现有关PAEs污染情况的报道，但数量很少。近 十年PAEs的测定方法也逐渐成熟。早期的方法有滴定法、比色法、分光光度法、 薄层色谱法等，但都不够灵敏，选择性都不够好。目前多采用气相色谱法和液 相色谱法，尤其是气质联用和液质联用法。目前基于气质联用的PAEs确证方法 己有报道。但气质联用要进行比较复杂的衍生化处理，因此，液质联用法(LC-ESI-MS/MS)显示出一定的优势。
技术实现思路
本专利技术的目的针对现有检测酞酸酯的技术中只能测定一种或几种酞酸酯 的不足和缺陷，提供一种可有效地检测出牛奶中多种酞酸酯含量的液质联用方 法，该方法旨在将基本包括现有牛奶所可能涉及的各种主要酞酸酯，使其能更 加快速、灵敏、简便地检测酞酸酯残留，以满足实际工作的需要。本专利技术的技术方案本专利技术建立的液质联用HPLC-ESI-MS/MS测定方法， 经过样品处理、液相分离、质谱检测三个步骤，同时检测牛奶中多种酞酸酯的 含量，包括牛奶中邻苯二甲酸二甲酯、苯二甲酸二乙酯、苯二甲酸二丁酯、苯 二甲酸二戊酯、苯二甲酸二环己酯、苯二甲酸二辛酯、苯二甲酸二异葵酯、苯 二甲酸二异辛酯和苯二甲酸丁基苄基酯等9种酞酸酯类化合物。(1) 样品前处理及提取净化称取蒙牛液态纯牛奶2g加到50mL的玻璃 离心管中，加入200ng的9种酞酸酯等量混合标准溶液，即加标100ppb，然后 涡旋混匀。再加入10mL的乙腈涡旋，接着再加0.8g NaCl进行涡旋并超声 10min，然后以2000 rpm低速离心10min。取上层乙腈清液到另一空的玻璃离 心管中进行真空旋转蒸发至干，然后加入色谱纯的甲醇涡旋溶解旋干物并定容 至lmL，转入至进样瓶进样。(2) 液相分离 液相条件为1、 色谱柱Symmetry C18， 5 |im， 100mmX2.1腿；2、 流动相A: 999/1000体积比的511111101醋酸铵重蒸水溶液+ 1/1000体积比的甲酸，流动相B:甲醇；3、 流速0.25mL/min;4、 梯度洗脱程序0 -2 min 20% B; 2-3.5 min 20%-95% B; 3.5 — 11 min 95%B; 11-12 min 95%-20%B; 12-13.5 min 20%B;各洗脱时间段中均以流动相 A补足余下的M数；5、 柱温常温；6、 进样量25pL;(3) 、质谱检测 质谱条件为1) 离子源电喷雾离子化电离源(ESI)，正离子监测(即ESI+);2) 扫描方式选择离子检测(SRM);3) 电离源温度80°C，去溶剂温度300 DC;4) 雾化气、鞘气为高纯氮气，碰撞气为高纯氦气；5) 喷雾源气体流速20 L/h;去溶剂气体流速350L/h;6) 喷雾电压、碰撞电压均自动优化至最佳灵敏度； 选择离子条件见表1。保留时间见图1。表1 LC- ESI -MS/MS法测定酞酸酯的电喷雾离子源的设置<table>table see original document page 5</column></row><table>(4)、浓度计算方法和检测限 按外标法以峰面积法计算牛奶中这9种酞酸酯的浓度。 本专利技术方法的检测限为大约在5 20ppb之间(信噪比》3)，回收率在65.28。/。~98.33%，变异系数(RSD)为5.35%~ 11.22%。本专利技术的有益效果本专利技术方法灵敏度高、准确度和精密度好，专属性及 确证性可靠，而且非常简便并可易于实际检测应用，且可非常好地满足实际检 测中的需要。采用LC- ESI -MS/MS方法对上述9种有可能造成牛奶污染的酞酸 酯进行同时检测的方法，目前尚未见有相应的报道。 附图说明图l、 9种酞酸酯标准品色谱图。图2、 9种酞酸酯的LC-ESI-MS/MS总离子色谱图。图3、牛奶加标色谱图。 具体实施例方式1材料1.1主要试剂和材料甲醇色谱纯 乙腈色谱纯Merk公司 Merk公司南京化学试剂公司国药集团上海化学试剂有限公司蒙牛纯牛奶国家环保总局标准品研究所 自制三氯乙酸分析纯氯化钠(AR)液态牛奶酞酸酯标准品 重蒸水1.2主要仪器Accela高效液相(包括autosampler禾口 accela pump)及TSQ Quantum Access质BP211D型电子分析天平 德国赛多利斯公司 KQ-250DE型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司 BUCffl Rotavapor R-200真空旋转蒸发仪 1.3标准品储备液9种酞酸酯分别配成lmg/mL的甲醇溶液，再混合成各酞酸酯含量从Ing/mL ~lpg/mL —系列稀释浓度的混合储备液。 2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种经过样品处理、液相分离、质谱检测三个步骤，， （１）样品前处理及提取净化：称取蒙牛液态纯牛奶２ｇ加到５０ｍＬ的玻璃离心管中，加入２００ｎｇ的９种酞酸酯等量混合标准溶液，即加标１００ｐｐｂ，然后涡旋混匀，再加入１０ｍＬ的乙腈涡旋，接 着再加０．８ｇ ＮａＣｌ进行涡旋并超声１０ｍｉｎ，然后以２０００ｒｐｍ低速离心１０ｍｉｎ，取上层乙腈清液到另一空的玻璃离心管中进行真空旋转蒸发至干，然后加入色谱纯的甲醇涡旋溶解旋干物并定容至１ｍＬ，转入至进样瓶进样； （２）液相分离： 液相条件为： ①色谱柱：Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ↓［１８］，５μｍ，１００ｍｍ×２．１ｍｍ； ②流动相Ａ：９９９／１０００体积比的５ｍｍｏｌ醋酸铵重蒸水溶液＋１／１０００体积比的甲酸，流动相Ｂ：甲醇； ③流速：０．２５ ｍＬ／ｍｉｎ； ④梯度洗脱程序：０－２ｍｉｎ ２０％Ｂ；２－３．５ｍｉｎ ２０％－９５％Ｂ；３．５－１１ｍｉｎ９５％Ｂ；１１－１２ｍｉｎ ９５％－２０％Ｂ；１２－１３．５ｍｉｎ ２０％Ｂ；各洗脱时间段中均以流动相Ａ补足余下的％数； ⑤柱温：常温； ⑥进样量：２５μＬ； （３）质谱检测： 质谱条件为： １）离子源：电喷雾离子化电离源ＥＳＩ，正离子监测即ＥＳＩ＋； ２）扫描方式：选择离子检测ＳＲＭ； ３）电离源温度：８０℃，去溶剂温 度：３００℃； ４）雾化气、鞘气为高纯氮气，碰撞气为高纯氦气； ５）喷雾源气体流速２０Ｌ／ｈ；去溶剂气体流速：３５０Ｌ／ｈ； ６）喷雾电压、碰撞电压均自动优化至最佳灵敏度； 选择离子条件：正离子ＳＲＭ扫描分析时，各酞 酸酯的离子选择通道ｍ／ｚ分别为：邻苯二甲酸二甲酯１９５／１６３、邻苯二甲酸二乙酯２２３／１４９、邻苯二甲酸二丁酯２７９／１４９、邻苯二甲酸二戊酯３０７／１４９、邻苯二甲酸二环己酯３３１／１４９、邻苯二甲酸二辛酯４１３／３０１、邻苯二甲酸二异葵酯４４７／１４９、邻苯二甲酸二异辛酯３９１／１４９、邻苯二甲酸丁基苄基酯３１３／１４９； （４）、浓度计算方法和检测限： 按外标法以峰面积法计算牛奶中这９种酞酸酯的浓度。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，李灼坤，丁涛，徐丽广，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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