一种生物拆分L-薄荷醇反应中提高底物浓度的方法技术

一种生物拆分Ｌ－薄荷醇反应中提高底物浓度的方法，属于生物法拆分外消旋化合物技术领域。本发明专利技术为在不对称拆分ＤＬ－乙酸薄荷酯反应体系中，控制体系ｐＨ值在５．０～８．０，转化菌株在华根霉（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）ＣＣＴＣＣ　Ｍ２０１０２１，米根霉（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）ＡＳ　３．４１，近平滑假丝酵母ＣＩＣＣ　１６７６，洋葱布克氏菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ）ＡＴＣＣ　２５４１６，荧光假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＡＳ１．８２３、或荧光假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＡＳ　１．５５中获得，添加树脂ＨＺ－８０１、ＨＺ－８１６、Ｄ－３１５、Ｄ－２０２、ＨＤ－８１、ＮＫＡ－Ⅱ、Ｄ－４０６、ＤＡ－２０１之一种，提高单批次转化底物ＤＬ－乙酸薄荷酯的浓度达６倍。

【技术实现步骤摘要】

一种生物拆分L-薄荷醇反应中提高底物浓度的方法，属于生物法拆分外消 旋化合物
技术背景薄荷醇是目前最有工业价值的手性化合物之一，分别在医药、食品、化妆 品和手性试剂制备等领域广泛应用。开展薄荷醇的拆分方法的研究极有意义。天然薄荷醇受天气、地域等影响，产量和质量波动较大，合成薄荷醇则可 以解决以上问题。近年来，生物学拆分方法已成为手性拆分的主流趋势。目前本研究室已经从华根霉(i /^c;p^ c/n'm^) CCTCC M201021，米根霉 wy加e) AS 3.41，近平滑假丝酵母CICC 1676，洋葱布克氏菌 (5wrA:/ oAien'a cepa,a)ATCC 25416， 荧光假单胞菌(尸sew(iomowas /7womscmy)AS 1.823、荧光假单胞菌(Psewcfowowas/Jworescews)AS 1.55中筛选出能够不对称拆分 DL-乙酸薄荷酯的菌种，但其存在较强的产物抑制作用，使得转化的底物浓度过 低，15g/L干菌体浓度，单批次转化底物浓度最高为1%。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种生物拆分L-薄荷醇反应中提高底物浓度的方法， 能够提高单批次转化底物浓度，提高产物L-薄荷醇的产率。本专利技术的技术方案 一种生物拆分L-薄荷醇反应屮提高底物浓度的方法， 其特征是在不对称拆分底物DL-乙酸薄荷酯反应体系中，转化菌株在华根霉 (J /n!zopw c/n'era/ CCTCC M201021 (公开号CN1443841A已报道，2003年9 月24日公开)，米根霉(i /n'zqpwsoo^ae)AS3.41,近平滑假丝酵母CICC 1676， 洋葱布克氏菌(Bwr狄o/^r/cepw》)ATCC 25416，荧光假单胞菌(尸化w^W2朋ay / Morcscera)AS 1.823、或荧光假单胞菌(尸seMctomowas^/Jworesces)AS 1.55中获得， 添加树脂HZ-801、 HZ-816、 D誦315、 D-202、 D-406、 HD-81、 NKA-II、 DA-201 之一种，底物质量浓度5%-6%，树脂添加量为底物DL-乙酸薄荷酯等质量，体 系pH 5.0-8.0，控制温度25~35°C，树脂在反应开始2~4h后加入，摇床反应 12~48h，转化率达45% 48%， L-薄荷醇的光学纯度为92%ee 100%ee。本专利技术从筛选树脂出发，筛选出能以一定速率吸附和释放产物，降低产物 对反应的抑制作用，提高菌种单批次转化效率的树脂。在此基础上，对该树脂 的添加量、添加时间，转化反应时间等条件进行优化。主要试剂DL-乙酸薄荷酯，L-薄荷醇，D-薄荷醇， DL-薄荷醇购于美国Sigma-Aldrich公司DA-201江苏苏青污水处理有限公司NKA-II、 D-406天津海光化工有限公司HD-81、 HZ-801、 HZ-816、 D國315、 D-202华东理工大学上海华震科技有限公司DL-薄荷醇和DL-乙酸薄荷酯分析方法的确定L-薄荷醇、D-薄荷醇、L-乙酸薄荷酯、D-乙酸薄荷酯标样在P-DEX-120色 谱柱(购于美国Supelco公司)上，通过带有FID检测器的手性气相色谱(Varian 3900)进行分析。L-乙酸薄荷酯的保留时间为19.6min， D-乙酸薄荷酯的保留时 间为20.6min， D-薄荷醇的保留时间为20.8min， L-薄荷醇的保留时间为21.1min。 确定具体色谱条件手性柱卩-DEX-120 (25mx0.25mmx0.25 (im);分流比 1 : 100;进样口温度25(TC;检测器温度30(TC;载气H2;载气流量2.5mL/min; 柱升温度程序为80'C保持4min， 2'C/min升温至120°C,保持lmin。在该条件 下L-薄荷醇、D-薄荷醇、L-乙酸薄荷酯、D-乙酸薄荷酯均可以达到基线分离。 产物的光学纯度通过对映过量值(％ee)来评价。 反应后产物eep值 ％eep=[(SL—SD)/(SL+SD)] X 100%反应后底物eej直 ％ees=[(SD — SL')/(SL'+SD')] X 100%反应转化率 转化率(％) = [(ees +ee。)/( ees + eep)] X 100%SL:反应后L-薄荷醇的峰面积；SD:反应后D-薄荷醇的峰面积；SL':反应后L-乙酸薄荷酯的峰面积；SD':反应后D-乙酸薄荷醇的峰面积；eeo:反应起始时底物ee值。一、 树脂的确定经过从各公司购买的树脂进行筛选，从解决减少产物抑制作用来提高底物浓度角度和保证转化效果两个方面考虑，选择添加树脂后，转化底物浓度大于5%，光学纯度为92。/。ee 98。/。ee。，转化率45% 48%。二、 树脂条件和底物浓度的优化分别考察了树脂添加量、添加时间，菌 体添加量，反应时间，底物浓度的影响。最终确定转化条件底物质量浓度5%-6%，控制温度25 35C，反应2 4h后添加树脂，树脂添加量与底物质量相 同，转化时间12~48h。优化后生物不对称拆分产物L-薄荷醇的光学纯度为 95%ee~100%ee。本专利技术的有益效果本专利技术通过添加树脂提高了底物的浓度。在转化过程 中加入一定量的树脂，能够明显减少产物薄荷醇对反应的抑制作用，从而提高 了单批次转化的底物浓度。通过条件优化，将转化的底物浓度从1%提高到6%，提高了6倍。本专利技术有助于进一步了解减少产物抑制的方法，对今后转化过程中通过减 少产物抑制来提高底物浓度提供了参考价值。并为生物法手性化合物生产实现规模化提供了思路。具体实施方式为了更好的理解本专利技术，下面结合实施例进一步阐明本专利技术的内容，但本 专利技术的内容不仅仅局限于下面的实施例。 实施例1在5mL、 50mmol/L的Na2HP04-KH2P04缓冲液中(pH7.0)，加入0.8g华根 霉(/ /^c;pz^c/2/m^) CCTCCM201021转化菌体细胞和0.25g DL-乙酸薄荷酉旨， 于3(TC的恒温摇床上振荡反应，211后添加0.25§树脂112-816，整个过程24h， 反应后，混合物离心，取上清用乙酸乙酯萃取产物和底物，手性气相色谱分析 产物，产物L-薄荷醇光学纯度98% ee，转化率46.7%。实施例2在5mL、 50mmol/L的Na2HP04-KH2P04缓冲液中(pH6.0)，加入0.8g近平 滑假丝酵母CICC 1676转化菌体细胞和0.3gDL-乙酸薄荷酯，于30'C的恒温摇 床上振荡反应，2h后添加0.3g树脂D-202,整个过程24h，反应后，混合物离 心，取上清用乙酸乙酯萃取产物和底物，手性气相色谱分析产物，产物L-薄荷 醇光学纯度97.3。/。ee，转化率46.3%。对照实施例不添加树脂，其他操作同实施例1，底物浓度最高为1%。若底物浓度为6%， 产物L-薄荷醇光学纯度为92.1% ee，转化率为33.1%。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物拆分Ｌ－薄荷醇反应中提高底物浓度的方法，其特征是在不对称拆分底物ＤＬ－乙酸薄荷酯反应体系中，转化菌株在华根霉（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）ＣＣＴＣＣ　Ｍ２０１０２１，米根霉（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）ＡＳ　３．４１，近平滑假丝酵母ＣＩＣＣ１６７６，洋葱布克氏菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ）ＡＴＣＣ　２５４１６，荧光假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＡＳ　１．８２３、或荧光假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＡＳ　１．５５中获得，底物质量浓度５％－６％，添加树脂ＨＺ－８０１、ＨＺ－８１６、Ｄ－３１５、Ｄ－２０２、Ｄ－４０６、ＨＤ－８１、ＮＫＡ－Ⅱ、ＤＡ－２０１之一种，树脂添加量为底物ＤＬ－乙酸薄荷酯等质量，体系ｐＨ５．０～８．０，控制温度２５～３５℃，树脂在反应开始２～４ｈ后加入，摇床反应１２～４８ｈ，转化率达４５％～４８％，Ｌ－薄荷醇的光学纯度为９２％ｅｅ～１００％ｅｅ。

【技术特征摘要】
1、一种生物拆分L-薄荷醇反应中提高底物浓度的方法，其特征是在不对称拆分底物DL-乙酸薄荷酯反应体系中，转化菌株在华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021，米根霉(Rhizopus oryzae)AS 3.41，近平滑假丝酵母CICC1676，洋葱布克氏菌(Burkholderia cepacia)ATCC 25416，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.823、...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻晓蔚，徐岩，顾鸿，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]