一种去除RNA样本中rRNA的方法技术

本发明专利技术公开一种去除RNA样本中rRNA的方法，首先设计rRNA特异性引物，所述rRNA特异性引物包括28S引物对和18S引物对；接着利用所述rRNA特异性引物对提取的RNA样本进行扩增、变性、环化、纯化，获得纯化产物；利用滚环复制引物组和所述纯化产物制备rRNA长探针；再将所述rRNA长探针与待处理的RNA样本进行混合杂交，然后使用磁珠吸附，获得去除rRNA后的RNA样本。本发明专利技术的检测方法仅依靠一步磁珠纯化即可去除样品中的特定序列，不同于现有技术中常用的利用RNaseH、DNAase消化序列方法、这样可以大大节省流程时间、降低建库成本。降低建库成本。降低建库成本。

【技术实现步骤摘要】
一种去除RNA样本中rRNA的方法


[0001]本专利技术涉及涉及基因生物领域，特别涉及rRNA
，具体涉及一种去除RNA样本中rRNA的方法。

技术介绍

[0002]遗传中心法则表明，DNA是生物体内遗传信息的载体。遗传信息在精密的调控下从DNA转录成RNA，再传递到蛋白质。因此RNA被认为是DNA与蛋白质之间生物信息传递的“桥梁”，在研究转录组信息中占有着重大的作用。
[0003]随着人类基因组计划（HGP）和DNA元件百科全书计划（ENCODE）的完成，人们发现在人类基因组中大部分DNA都可以转录成RNA，但是仅有1.5%的核苷酸序列用于蛋白质的编码，剩余不编码蛋白质的的非编码RNA（ncRNA），被认为是基因组转录噪音。这种转录组噪音（无效信息）基本全部来源于丰度最高的成员——rRNA，而核糖体RNA(rRNA) 约占RNA总量的 80%，是最多的一类RNA，通常这类RNA分子量比较大且代谢不活跃，在进行全转录组测序建库过程中，需要将这些冗余序列去除掉，提高数据利用效率。现有方法主要包括生物素耦联的探针抓取法和探针辅助的RNaseH、DNAase消化法，该现有方法的操作步骤多、耗时长，且建库成本也高。

技术实现思路

[0004]本专利技术的主要目的是提出一种去除RNA样本中rRNA的方法，旨在解决现有技术中操作步骤多，耗时长，且建库成本高的技术问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提出一种去除RNA样本中rRNA的方法，包括以下步骤：设计rRNA特异性引物，所述rRNA特异性引物包括28S引物对和18S引物对；利用所述rRNA特异性引物对提取的RNA样本进行扩增、变性、环化、纯化，获得纯化产物；利用滚环复制引物组和所述纯化产物制备rRNA长探针；将所述rRNA长探针与待处理的RNA样本进行混合杂交，然后使用磁珠吸附，获得去除rRNA后的RNA样本。
[0006]可选地，设计rRNA特异性引物，所述rRNA特异性引物包括28S引物对和18S引物对的步骤中，所述28S引物对的正向引物的5
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端和所述18S引物对中的正向引物的5
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端均含有磷酸根修饰，所述28S引物对的反向引物的5
’
端和所述18S引物对中的反向引物的5
’
端均不含磷酸根，且序列一致。
[0007]可选地，所述28S引物对的正向引物的序列如SEQ ID NO：1所示；和/或，所述28S引物对的反向引物的序列如SEQ ID NO：2所示；和/或，所述18S引物对的正向引物的序列如SEQ ID NO：3所示；和/或，所述18S引物对的反向引物的序列如SEQ ID NO：4所示。
[0008]可选地，利用所述rRNA特异性引物对提取的RNA样本进行扩增、变性、环化、纯化，
获得纯化产物的步骤包括：提取RNA样本，合成cDNA，以所述cDNA为模板，利用所述rRNA特异性引物进行PCR扩增，得到扩增产物；将所述扩增产物经过变性形成DNA单链分子，然后在连接酶或环化酶作用下使分子内成环，获得环化DNA分子；利用线性DNA消化酶降解所述环化DNA分子中未成环的DNA分子，再使用磁珠对所述环化DNA分子进行纯化，获得纯化产物。
[0009]可选地，所述滚环复制引物组包括第一滚环复制引物、第二滚环复制引物、第三滚环复制引物、第四滚环复制引物、第五滚环复制引物、第六滚环复制引物、第七滚环复制引物、第八滚环复制引物、第九滚环复制引物、第十滚环复制引物、第十一滚环复制引物、第十二滚环复制引物和第十三滚环复制引物，其对应的序列依次如SEQ ID NO：5所示、SEQ ID NO：6所示、SEQ ID NO：7所示、SEQ ID NO：8所示、SEQ ID NO：9所示、SEQ ID NO：10所示、SEQ ID NO：11所示、SEQ ID NO：12所示、SEQ ID NO：13所示、SEQ ID NO：14所示、SEQ ID NO：15所示、SEQ ID NO：16所示、SEQ ID NO：17所示。
[0010]可选地，利用滚环复制引物组和所述纯化产物制备rRNA长探针的步骤包括：将所述滚环复制引物组与所述纯化产物变性杂交，所得混合物在phi29聚合酶的催化下，体外扩增后，产生含rRNA互补序列的长片段，所述长片段包括28S的长探针和18S的长探针；将获得的所述28S的长探针和所述18S的长探针按质量比（2.5~3）：1混合，经磁珠纯化后，获得所述r RNA的长探针。
[0011]可选地，将所述rRNA长探针与待处理的RNA样本进行混合杂交，然后使用磁珠吸附，获得去除rRNA后的RNA样本的步骤包括：将待处理的RNA样本片段化，获得RNA片段；将获得的所述RNA片段与所述rRNA的长探针混合杂交，获得杂交产物；向所述杂交产物中加入磁珠吸附，获得去除r RNA后的RNA样本。
[0012]可选地，将所述rRNA长探针与待处理的RNA样本进行混合杂交，然后使用磁珠吸附，获得去除rRNA后的RNA样本的步骤中，所述磁珠吸附使用的磁珠是0.5x磁珠。
[0013]可选地，将所述rRNA长探针与待处理的RNA样本进行混合杂交，然后使用磁珠吸附，获得去除rRNA后的RNA样本的步骤中，所述RNA片段的长度为300~500bp。
[0014]可选地，将所述rRNA长探针与待处理的RNA样本进行混合杂交，然后使用磁珠吸附，获得去除rRNA后的RNA样本的步骤中，所述RNA样本来源于人源细胞。
[0015]本专利技术提供一种去除RNA样本中rRNA的方法，本专利技术的技术方案中，通过先设计rRNA特异性引物，对提取的RNA样本进行扩增、变性、环化成DNA分子，形成稳定的环状结构，最后仅依靠一步磁珠纯化即可去除样品中的特定序列，相比较以前的生物素耦联的探针抓取法和探针辅助的RNaseH消化法可以大大节省流程时间、降低建库成本。
附图说明
[0016]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本
专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
[0017]图1为本专利技术提供的一种去除RNA样本中rRNA的方法的流程示意图；图2为实施例1与对比例1和对比例2的去除rRNA的效率柱状图；图3为实施例1的磁珠倍数与RNA损失量和探针残留量关系的测定；图4为实施例1中去除RNA样本中rRNA的方法与对比例去除RNA样本中rRNA的方法的流程以及相对应的使用时间的流程图。
[0018]本专利技术目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
[0019]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种去除RNA样本中rRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：S10、设计rRNA特异性引物，所述rRNA特异性引物包括28S引物对和18S引物对；S20、利用所述rRNA特异性引物对提取的RNA样本进行扩增、变性、环化、纯化，获得纯化产物；S30、利用滚环复制引物组和所述纯化产物制备rRNA长探针；S40、将所述rRNA长探针与待处理的RNA样本进行混合杂交，然后使用磁珠吸附，获得去除rRNA后的RNA样本。2.如权利要求1所述去除RNA样本中rRNA的方法，其特征在于，设计rRNA特异性引物，所述rRNA特异性引物包括28S引物对和18S引物对的步骤中，所述28S引物对的正向引物的5
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端和所述18S引物对的正向引物的5
’
端均含有磷酸根修饰，所述28S引物对的反向引物的5
’
端和所述18S引物对的反向引物的5
’
端均不含磷酸根，且序列一致。3.如权利要求2所述去除RNA样本中rRNA的方法，其特征在于，所述28S引物对的正向引物的序列如SEQ ID NO：1所示；和/或，所述28S引物对的反向引物的序列如SEQ ID NO：2所示；和/或，所述18S引物对的正向引物的序列如SEQ ID NO：3所示；和/或，所述18S引物对的反向引物的序列如SEQ ID NO：4所示。4.如权利要求1所述去除RNA样本中rRNA的方法，其特征在于，利用所述rRNA特异性引物对提取的RNA样本进行扩增、变性、环化、纯化，获得纯化产物的步骤包括：提取RNA样本，合成cDNA，以所述cDNA为模板，利用所述rRNA特异性引物进行PCR扩增，得到扩增产物；将所述扩增产物经过变性形成DNA单链分子，然后在连接酶或环化酶作用下使分子内成环，获得环化DNA分子；利用线性DNA消化酶降解所述环化DNA分子中未成环的DNA分子，再使用磁珠对所述环化DNA分子进行纯化，获得纯化产物。5.如权利要求1所述去除RNA样本中rRNA的方法，其特征在于，利用滚环复制引物组和所述纯化产物制备rRNA长探针的步骤包括：所述滚环复制组包括第一滚环复制引物、第二滚环复制引物、第四滚环复制引物、第五滚环复制引物、第六滚环复制引物、...

【专利技术属性】
技术研发人员：张怡然，段小红，郝艳同，周冰，王冰，周启明，
申请(专利权)人：求臻医学科技浙江有限公司，
类型：发明
国别省市：