【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】CRISPR/Cas系统及其用途
[0001]相关申请的引用
[0002]本申请根据35U.S.C.365(b)要求于2021年6月29日提交的国际专利申请号PCT/CN 2021/103326的优先权，该申请的全部内容(包括任何附图及其序列表)通过引用并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且所述序列表通过引用以其全文特此并入。所述ASCII副本创建于2022年6月24日，名称为132045
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00719_SL.txt，并且大小为264,795字节。
技术介绍
[0005]CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)是在原核生物(如细菌和古细菌)的基因组中发现的DNA序列家族。这些序列应理解为源自先前已感染原核生物的噬菌体的DNA片段，并在随后的原核生物感染期间用于检测和破坏相似噬菌体的DNA。
[0006]CRISPR相关系统是一组同源基因或Cas基因，其中一些编码具有解旋酶和核酸酶活性的Cas蛋白。Cas蛋白是利用源自CRISPR序...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)
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Cas复合物，所述复合物包含：(1)RNA指导序列，其包含能够与靶RNA杂交的间隔序列以及在所述间隔序列的5
’
或3
’
的同向重复(DR)序列；和(2)CRISPR相关蛋白(Cas)或所述Cas的衍生物或功能性片段，所述CRISPR相关蛋白具有SEQ ID NO:2
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7和9
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17中的任一者的氨基酸序列；其中所述Cas、所述Cas的衍生物和功能性片段能够(i)与所述RNA指导序列结合，并且(ii)靶向所述靶RNA，条件是当所述复合物包含SEQ ID NO:2
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7和9
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17中的任一者的Cas时，所述间隔序列与天然存在的噬菌体核酸不是100％互补。2.如权利要求1所述的CRISPR
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Cas复合物，其中所述DR序列具有与SEQ IDNO:19
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24和26
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34中的任一者的二级结构基本相同的二级结构。3.如权利要求1所述的CRISPR
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Cas复合物，其中所述DR序列由SEQ ID NO:19
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24和26
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34中的任一者编码。4.如权利要求1、2或3所述的CRISPR
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Cas复合物，其中所述靶RNA由真核DNA编码。5.如权利要求4所述的CRISPR
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Cas复合物，其中所述真核DNA是非人哺乳动物DNA、非人灵长类动物DNA、人DNA、植物DNA、昆虫DNA、鸟DNA、爬行动物DNA、啮齿动物DNA、鱼DNA、蠕虫/线虫DNA、酵母DNA。6.如权利要求1
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5中任一项所述的CRISPR
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Cas复合物，其中所述靶RNA是mRNA。7.如权利要求1
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6中任一项所述的CRISPR
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Cas复合物，其中所述间隔序列在15
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55个核苷酸之间、在25
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35个核苷酸之间、或为约30个核苷酸。8.如权利要求1
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7中任一项所述的CRISPR
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Cas复合物，其中所述间隔序列与所述靶RNA是90％
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100％互补。9.如权利要求1
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8中任一项所述的CRISPR
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Cas复合物，其中所述衍生物与SEQ ID NO:2
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7和9
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17中的任一者具有至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性，或包含SEQ ID NO:2
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7和9
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17中的任一者的一个或多个残基的保守氨基酸取代。10.如权利要求9所述的CRISPR
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Cas复合物，其中所述衍生物仅包含保守氨基酸取代。11.如权利要求1
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10中任一项所述的CRISPR
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Cas复合物，其中所述衍生物在HEPN结构域或RXXXXH基序中具有与SEQ ID NO:2
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7和9
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17中的任一者的野生型Cas相同的序列。12.如权利要求1
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9中任一项所述的CRISPR
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Cas复合物，其中所述衍生物能够与杂交至所述靶RNA的RNA指导序列结合，但由于所述Cas的RNA酶催化位点突变而不具有RNA酶催化活性。13.如权利要求12所述的CRISPR
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Cas复合物，其中所述衍生物具有不超过210个残基的N
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末端缺失、和/或不超过180个残基的C
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末端缺失。14.如权利要求13所述的CRISPR
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Cas复合物，其中所述衍生物具有约180个残基的N
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末端缺失、和/或约150个残基的C
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末端缺失。15.如权利要求12
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14中任一项所述的CRISPR
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Cas复合物，其中所述衍生物进一步包含RNA碱基编辑结构域。16.如权利要求15所述的CRISPR
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Cas复合物，其中所述RNA碱基编辑结构域是腺苷脱氨酶，如双链RNA特异性腺苷脱氨酶(例如，ADAR1或ADAR2)；载脂蛋白B mRNA编辑酶；催化多肽
样(APOBEC)；或激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)。17.如权利要求16所述的CRISPR
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Cas复合物，其中所述ADAR具有E488Q/T375G双突变或者是ADAR2DD。18.如权利要求15
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17中任一项所述的CRISPR
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Cas复合物，其中将所述碱基编辑结构域与RNA结合结构域，如MS2进一步融合。19.如权利要求12
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14中任一项所述的CRISPR
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Cas复合物，其中所述衍生物进一步包含RNA甲基转移酶、RNA去甲基化酶、RNA剪接修饰子、定位因子或翻译修饰因子。20.如权利要求1
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19中任一项所述的CRISPR
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Cas复合物，其中所述Cas、所述衍生物或所述功能性片段包含核定位信号(NLS)序列或核输出信号(NES)。21.如权利要求1
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20中任一项所述的CRISPR
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Cas复合物，其中靶向所述靶RNA导致对所述靶RNA进行修饰。22.如权利要求21所述的CRISPR
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Cas复合物，其中所述靶RNA修饰是切割所述靶RNA。23.如权利要求21所述的CRISPR
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Cas复合物，其中所述靶RNA修饰是腺苷(A)脱氨基为肌苷(I)。24.如权利要求1
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23中任一项所述的CRISPR
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Cas复合物，所述CRISPR
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Cas复合物进一步包含靶RNA，所述靶RNA包含能够与所述间隔序列杂交的序列。25.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含(1)权利要求1
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24中任一项所述的Cas、其衍生物或其功能性片段，和(2)异源功能性结构域。26.如权利要求25所述的融合蛋白，其中所述异源功能性结构域包含：核定位信号(NLS)、报告蛋白或检测标记(例如，GST、HRP、CAT、GFP、HcRed、DsRed、CFP、YFP、BFP)、定位信号、蛋白靶向部分、DNA结合结构域(例如，MBP、Lex A DBD、Gal4 DBD)、表位标签(例如，His、myc、V5、FLAG、HA、VSV
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G、Trx等)、转录激活结构域(例如，VP64或VPR)、转录抑制结构域(例如，KRAB部分或SID部分)、核酸酶(例如，FokI)、脱氨基结构域(例如，ADAR1、ADAR2、APOBEC、AID或TAD)、甲基化酶、去甲基化酶、转录释放因子、HDAC、具有ssRNA切割活性的多肽、具有dsRNA切割活性的多肽、具有ssDNA切割活性的多肽、具有dsDNA切割活性的多肽、DNA或RNA连接酶、或其任何组合。27.如权利要求25或26所述的融合蛋白，其中将所述异源功能性结构域在所述融合蛋白的N
‑
末端、C
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末端或内部融合。28.一种缀合物，所述缀合物包含与(2)缀合的(1)：(1)权利要求1
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24中任一项所述的Cas、其衍生物或其功能性片段，(2)异源功能性部分。29.如权利要求28所述的缀合物，其中所述异源功能性部分包含：核定位信号(NLS)、报告蛋白或检测标记(例如，GST、HRP、CAT、GFP、HcRed、DsRed、CFP、YFP、BFP)、定位信号、蛋白靶向部分、DNA结合结构域(例如，MBP、Lex A DBD、Gal4 DBD)、表位标签(例如，His、myc、V5、FLAG、HA、VSV
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G、Trx等)、转录激活结构域(例如，VP64或VPR)、转录抑制结构域(例如，KRAB部分或SID部分)、核酸酶(例如，FokI)、脱氨基结构域(例如，ADAR1、ADAR2、APOBEC、AID或TAD)、甲基化酶、去甲基化酶、转录释放因子、HDAC、具有ssRNA切割活性的多肽、具有dsRNA切割活性的多肽、具有ssDNA切割活性的多肽、具有dsDNA切割活性的多肽、DNA或RNA连接酶、或其任何组合。30.如权利要求28或29所述的缀合物，其中所述异源功能性部分相对于所述Cas、其衍
生物或其功能性片段在N
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末端、C
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末端或内部缀合。31.一种编码SEQ ID NO:2
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7和9
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17中的任一者、或其衍生物、或其功能性片段、或其融合蛋白的多核苷酸，或与其具有至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的多核苷酸，条件是所述多核苷酸不是SEQ ID NO:1和8中的任一者。32.如权...
【专利技术属性】
技术研发人员：王兴，
申请(专利权)人：辉大上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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