【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)和crispr相关(cas)基因(统称为crispr-cas或crispr/cas系统)是古菌和细菌中保护特定物种免受外来遗传元件侵害的适应性免疫系统。
2、在本公开中对任何文献的引用或标识均不是承认该文献可作为本公开的现有技术获得。本公开中提及或引用的每一个参考文献均通过援引以其全文并入。
技术实现思路
1、针对以上
技术介绍
，本公开提供了优于现有技术的某些优点和进步。尽管本公开不限于特定的优点或功能，但在一方面，本公开提供了一种cas12f多肽，所述cas12f多肽包含与seq id no:1-34中的任一个(任选地seq id no:1、2、4、5、15、28、29、31和32中的任一个)具有至少约60％(例如，至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％)的序列同一性的氨基酸序列。
2、在另一方面，本公开提供了一种系统，所述系统包含：
3、(1)cas12f多肽或编码所述cas12f多肽的多核苷酸，所述cas12f多肽包含与seqid no:1-34中的任一个(任选地seq id no:1、2、4、5、15、28、29、31和32中的任一个)具有至少约60％(例如，至少约65％、70％、7
4、(2)指导核酸或编码所述指导核酸的多核苷酸，所述指导核酸包含：
5、(i)能够与所述cas12f多肽形成复合物的支架序列；和
6、(ii)能够与靶dna的靶序列杂交、从而将所述复合物引导至所述靶dna的指导序列。
7、在又另一方面，本公开提供了编码本公开的cas12f多肽的多核苷酸。
8、在又另一方面，本公开提供了递送系统，所述递送系统包含(1)本公开的cas12f多肽、本公开的多核苷酸或本公开的系统；和(2)递送媒介物。
9、在又另一方面，本公开提供了载体，所述载体包含本公开的多核苷酸；任选地，其中所述载体编码如本公开中所定义的指导核酸；任选地，其中所述载体是质粒载体、重组aav(raav)载体或重组慢病毒载体。
10、在又另一方面，本公开提供了核糖核蛋白(rnp)，所述核糖核蛋白包含本公开的cas12f多肽和任选地如本公开中所定义的指导核酸。
11、在又另一方面，本公开提供了脂质纳米颗粒(lnp)，所述脂质纳米颗粒包含本公开9的cas12f多肽或本公开的系统。
12、在又另一方面，本公开提供了用于修饰靶dna的方法，所述方法包括使所述靶dna与本公开的系统、本公开的载体、本公开的核糖核蛋白或本公开的脂质纳米颗粒接触，其中所述间隔子序列能够与所述靶dna的靶序列杂交，其中所述靶dna被所述复合物修饰。
13、在又另一方面，本公开提供了通过本公开的方法修饰的细胞。
14、在又另一方面，本公开提供了药物组合物，所述药物组合物包含(1)本公开的系统、本公开的载体、本公开的核糖核蛋白、本公开的脂质纳米颗粒或本公开的细胞；和(2)药学上可接受的赋形剂。
15、在又另一方面，本公开提供了一种用于诊断、预防或治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用本公开的系统、权利要求29所述的载体、本公开的核糖核蛋白、本公开的脂质纳米颗粒、本公开的细胞或本公开的药物组合物，其中所述疾病与靶dna关联，其中所述间隔子序列能够与所述靶dna的靶序列杂交，其中所述靶dna被所述复合物修饰，并且其中所述靶dna的修饰诊断、预防或治疗所述疾病。
16、在下面的说明书中阐述了本公开的一个或多个实施方式的细节。本公开的其他特征或优点从以下附图和若干实施方式的详细描述中并且从所述权利要求中应当是清楚的。应理解，除非另外指示，否则本公开的任何方面或实施方式都可以与本公开的任何其他方面或实施方式组合，以构成本文明确或隐晦公开的另一个实施方式。
17、概述
18、cas12f，作为2类v型crispr相关蛋白(cas12)的亚型，能够与靶核酸(例如，dsdna)结合或在其上发挥作用，如通过包含靶向所述靶核酸的指导序列的指导核酸(例如，指导rna(grna，在公开中与单指导rna或sgrna可互换使用))引导。在一些实施方式中，所述靶核酸是真核核酸。
19、不希望受理论束缚，在一些实施方式中，所述指导核酸包含负责与cas12f形成复合物的支架序列，以及被有意设计成负责与靶核酸的靶序列杂交的指导序列(在本公开中与间隔子序列可互换使用)，从而将包含cas12f和指导核酸的复合物引导至所述靶核酸。
20、参考图24，示例性靶dsdna(例如，靶基因)被描绘成包含5’至3’单dna链和3’至5’单dna链。
21、示例性指导核酸被描述为包含指导序列和支架序列。指导序列被设计成与3’至5’单dna链的一部分杂交，并且因此指导序列“靶向”此部分。因此，3’至5’单dna链被称为靶dsdna的“靶链(ts)”，而相反的5’至3’单dna链被称为靶dsdna的“非靶链(nts)”。基于其设计指导序列并且指导序列可以与其杂交的靶链的此部分被称为“靶序列”，而非靶链上对应于此部分的相反部分被称为“原间隔子序列”，所述原间隔子序列与靶序列100％(完全)反向互补。
22、通常，核酸序列(例如，dna序列、rna序列)以5’至3’的方向/取向书写。
23、例如，对于atgc的dna序列，除非另外指示，否则通常将其理解为5’-atgc-3’。其反向序列是5’-cgta-3’，其完全互补体序列是5’-tacg-3’，并且其完全反向互补体序列是5’-gcat-3’。
24、通常，除非另外指示，否则dsdna的双链序列可以用其5’至3’单dna链的序列表示，常规地以5’至3’方向/取向书写。
25、例如，对于具有5’-atgc-3’的5’至3’单dna链和3’-tacg-5’的3’至5’单dna链的dsdna，dsdna可以简单地表示为5’-atgc-3’。
26、5’-----atgc-----3’
27、3’-----tacg-----5’
28、应注意，dsdna的5’至3’单dna链或3’至5’单dna链可以是从中选择原间隔子序列的非靶链，或者可以是指导序列被设计成与其杂交的靶链。
29、通常，对于作为dsdna的基因，5’至3’本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Cas12f多肽，所述Cas12f多肽包含与SEQ ID NO:1-34中的任一个(任选地SEQID NO:1、2、4、5、15、28、29、31和32中的任一个)具有至少约60％(例如，至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％)的序列同一性的氨基酸序列。
2.一种系统，所述系统包含：
3.如任一项前述权利要求所述的Cas12f多肽或系统，其中所述Cas12f多肽不是SEQ IDNO:1-34中的任一个(任选地SEQ ID NO:1、2、4、5、15、28、29、31和32中的任一个)。
4.如任一项前述权利要求所述的Cas12f多肽或系统，其中所述Cas12f多肽具有SEQ IDNO:1-34中的任一个(任选地SEQ ID NO:1、2、4、5、15、28、29、31和32中的任一个)的功能(例如，与后者相比增加或降低的经修饰功能)(所
5.如任一项前述权利要求所述的Cas12f多肽或系统，其中所述Cas12f多肽具有指导序列特异性(中靶)dsDNA切割活性；
6.如任一项前述权利要求所述的Cas12f多肽或系统，其中当两者与相同的指导核酸组合使用时，与SEQ ID NO:1-34中的任一个(任选地SEQ ID NO:1、2、4、5、15、28、29、31和32中的任一个)相比，所述Cas12f多肽具有增加的指导序列特异性(中靶)dsDNA切割活性，例如增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％或更多。
7.如任一项前述权利要求所述的Cas12f多肽或系统，其中所述Cas12f多肽包含SEQ IDNO:1的位置46、49、50、52、53、54、56、57、62、63、66、70、71、72、119、120、127、132、136、141、144、146、147、148、150、264、292、293、311、313、314和/或315处的氨基酸取代。
8.如任一项前述权利要求所述的Cas12f多肽或系统，其中所述Cas12f多肽包含SEQ IDNO:2的位置10、11、13、14、15、17、18、19、20、27、28、31、32、40、44、47、49、51、52、55、56、59、61、63、65、68、71、84、91、94、96、99、111、112、124、125、126、127、128、129、130、131、139、140、141、146、147、150、151、156、160、163、167、170、173、178、179、180、183、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、206、215、224、225、226、227、230、235、249、254、256、257、264、265、266、269、270、272、273、276、280、283、292、295、303、309、311、313、314、316、318、319、320、321、334、337、341、344、346、349、358、363、365、366、367、368、371、372、374、375、377、380、382、393、399、403、404、406、408、409、410、411、413和/或414处的氨基酸取代。
9.如任一项前述权利要求所述的Cas12f多肽或系统，其中所述氨基酸取代是用带正电荷的氨基酸残基(诸如赖氨酸(Lys/K)、精氨酸(Arg/R)、组氨酸(His/H))进行的取代，并且任选地是用精氨酸(Arg/R)进行的取代。
10.如任一项前述权利要求所述的Cas12f多肽或系统，其中所述Cas12f多肽相对于SEQID NO:1包含氨基酸取代D52R和/或T132R；
11.如任...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种cas12f多肽，所述cas12f多肽包含与seq id no:1-34中的任一个(任选地seqid no:1、2、4、5、15、28、29、31和32中的任一个)具有至少约60％(例如，至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％)的序列同一性的氨基酸序列。
2.一种系统，所述系统包含：
3.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽不是seq idno:1-34中的任一个(任选地seq id no:1、2、4、5、15、28、29、31和32中的任一个)。
4.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽具有seq idno:1-34中的任一个(任选地seq id no:1、2、4、5、15、28、29、31和32中的任一个)的功能(例如，与后者相比增加或降低的经修饰功能)(所述功能例如，与指导核酸形成复合物的能力，所述指导核酸能够与seq id no:1-34中的任一个(任选地seq id no:1、2、4、5、15、28、29、31和32中的任一个)形成复合物；和/或指导序列特异性dsdna切割活性)。
5.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽具有指导序列特异性(中靶)dsdna切割活性；
6.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中当两者与相同的指导核酸组合使用时，与seq id no:1-34中的任一个(任选地seq id no:1、2、4、5、15、28、29、31和32中的任一个)相比，所述cas12f多肽具有增加的指导序列特异性(中靶)dsdna切割活性，例如增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％或更多。
7.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽包含seq idno:1的位置46、49、50、52、53、54、56、57、62、63、66、70、71、72、119、120、127、132、136、141、144、146、147、148、150、264、292、293、311、313、314和/或315处的氨基酸取代。
8.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽包含seq idno:2的位置10、11、13、14、15、17、18、19、20、27、28、31、32、40、44、47、49、51、52、55、56、59、61、63、65、68、71、84、91、94、96、99、111、112、124、125、126、127、128、129、130、131、139、140、141、146、147、150、151、156、160、163、167、170、173、178、179、180、183、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、206、215、224、225、226、227、230、235、249、254、256、257、264、265、266、269、270、272、273、276、280、283、292、295、303、309、311、313、314、316、318、319、320、321、334、337、341、344、346、349、358、363、365、366、367、368、371、372、374、375、377、380、382、393、399、403、404、406、408、409、410、411、413和/或414处的氨基酸取代。
9.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述氨基酸取代是用带正电荷的氨基酸残基(诸如赖氨酸(lys/k)、精氨酸(arg/r)、组氨酸(his/h))进行的取代，并且任选地是用精氨酸(arg/r)进行的取代。
10.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽相对于seqid no:1包含氨基酸取代d52r和/或t132r；
11.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽相对于seqid no:2包含氨基酸取代a56r、y125r、s130r、t131r、i264r、l270r和/或a273r；
12.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽基本上缺乏指导序列非依赖性(脱靶)dsdna切割活性；
13.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽进一步被工程化成基本上缺乏指导序列特异性(中靶)dsdna切割活性；
14.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽包含seqid no:1的位置44、79、81、82、125、131、133、138、149、151、153、228、268、270、271、274、275、277、279、282、287、291、305、308、312和/或406处的氨基酸取代。
15.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽包含seqid no:2的位置4、7、9、23、30、33、34、35、37、38、39、41、42、46、60、62、67、69、72、75、76、77、78、80、81、82、86、90、93、97、98、101、105、107、108、114、116、121、123、135、137、143、145、148、162、165、177、185、187、189、190、207、208、209、210、212、216、217、218、219、220、231、243、278、289、290、293、296、297、302、305、307、308、310、326、327、328、329、332、336、340、347、350、356、359、362、376、378、381、388、390、391、392、395和/或396处的氨基酸取代。
16.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述氨基酸取代是用(1)带正电荷的氨基酸残基(诸如赖氨酸(lys/k)、精氨酸(arg/r)、组氨酸(his/h))进行的取代，并且任选地是用精氨酸(arg/r)进行的取代；或是用(2)非极性氨基酸残基(诸如甘氨酸(gly/g)、丙氨酸(ala/a)、缬氨酸(val/v)、半胱氨酸(cys/c)、脯氨酸(pro/p)、亮氨酸(leu/l)、异亮氨酸(ile/i)、甲硫氨酸(met/m)、色氨酸(trp/w)、苯丙氨酸(phe/f))进行的取代，并且任选地是用丙氨酸(ala/a)进行的取代。
17.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽相对于seqid no:1包含氨基酸取代d228a和/或t406a；
18.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽相对于seqid no:1包含氨基酸取代d52r、t132r、d228a和t406a；
19.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽相对于seqid no:2包含氨基酸取代d210a和/或d388a；
20.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽相对于seqid no:2包含氨基酸取代d210a、l270r和d388a；
21.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽进一步被工程化成切口酶。
22.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽进一步包含与所述cas12f多肽融合的功能结构域；
23.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽相对于seqid no:1包含氨基酸取代d52r、t132r、d228a和t406a，并且包含碱基编辑结构域，例如脱氨酶或其催化结构域。
24.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽包含seqid no:260-265中任一个的氨基酸序列，或与seq id no:260-265中的任一个的氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％)的序列同一性的氨基酸序列。
25.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽与指导核酸组合使用，所述指导核酸包含：
26.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述指导核酸是指导rna(grna)，例如单指导rna(sgrna)。
27.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述支架序列在所述指导序列的5’。
28.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述指导核酸进一步包含polyu序列，所述polyu序列在所述指导序列的3’具有至少四个连续的u(尿苷)；
29.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述支架序列具有与seqid no:73-106中的任一个(任选地seq id no:73、74、76、77、87、100、101、103和104中的任一个)的二级结构基本上相同的二级结构。
30.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述支架序列包含与seqid no:73-106中的任一个(任选地seq id no:73、74、76、77、87、100、101、103和104中的任一个)具有至少约60％(例如，至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％)的序列同一性的多核苷酸序列。
31.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中当两者在其他方面相同的指导核酸中与相同的cas12f多肽(例如，任一项前述权利要求所述的cas12f多肽)组合使用时，与由seq id no:73-106中的任一个(任选地seq id no:73、74、76、77、87、100、101、103和104中的任一个)导致的相比，所述支架序列导致增加的指导序列特异性(中靶)dsdna切割活性，例如增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％或更多。
32.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述支架序列包含热力学不稳定的碱基对(例如，a-u碱基对或错配的碱基对)用g-c碱基对进行的碱基对取代。
33.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述支架序列相对于seqid no:73包含热力学不稳定的碱基对(例如，a-u碱基对或错配的碱基对)用g-c碱基对进行的碱基对取代，并且包含seq id no:234-236、239-242、244-247和250-251中任一个的多核苷酸序列，或与seq id no:234-236、239-242、244-247和250-251中的任一个的多核苷酸序列具有至少约80％(例如，至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％)的序列同一性的多核苷酸序列；任选地，其中所述支架序列包含seq id no:244的多核苷酸序列。
34.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述支架序列相对于seqid no:74包含热力学不稳定的碱基对(例如，a-u碱基对或错配的碱基对)用g-c碱基对进行的碱基对取代，并且包含seq id no:257的多核苷酸序列，或与seq id no:257的多核苷酸序列具有至少约80％(例如，至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％)的序列同一性的多核苷酸序列。
35.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽包含任一项前述权利要求中所定义的seq id no:1或其突变体(例如，seq id no:226)，并且其中所述支架序列包含任一项前述权利要求中所定义的seq id no:73或其突变体(例如，seq idno:244)。
36.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽包含任一项前述权利要求中所定义的seq id no:2或其突变体(例如，seq id no:227)，并且其中所述支架序列包含任一项前述权利要求中所定义的seq id no:74或其突变体(例如，seq idno:257)。
37.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽包含seqid no:3或其突变体，并且其中所述支架序列包含任一项前述权利要求中所定义的seq idno:75或其突变体。
38.如任一项前述权利要求所述的cas12f多肽或系统，其中所述cas12f多肽包含seqid no:4或其突变体，并且其中所述支架序列包含任一项前述权利要求中所定义的seq idno:76或其突变体。
39.如任一项前述权利要求所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：孔祥锋，王乐聪，孔旭强，
申请(专利权)人：辉大上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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