一种冷热肿瘤调控型CAR-单核/巨噬细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术一种冷热肿瘤调控型CAR

【技术实现步骤摘要】
一种冷热肿瘤调控型CAR
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单核/巨噬细胞及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于免疫学及肿瘤治疗
，具体涉及一种冷热肿瘤调控型CAR
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单核/巨噬细胞及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]随着肿瘤生物学和免疫学的发展，肿瘤免疫治疗已成为近年来肿瘤治疗领域的新途径。与传统化放疗相比，免疫治疗颠覆了人们以往对于肿瘤治疗的理念，从传统的依靠外界方式杀死肿瘤，到免疫治疗依靠自身免疫系统杀死肿瘤。其中免疫检查点抑制剂治疗、过继性免疫细胞治疗备受瞩目。
[0003]基于免疫检查点理论的单抗阻断治疗技术，以及基于细胞治疗技术平台的嵌合抗原受体T细胞(CAR
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T)技术受到广泛关注。免疫检查点阻断的肿瘤免疫治疗方法是通过阻断负荷肿瘤对T细胞的抑制途径来激活抗肿瘤免疫。目前抗PD1抗体药物已被用于治疗多种癌症，但仍然存在一些问题：(1)较低的客观应答率，PD1抑制剂在未经选择的实体瘤患者中，有效率只有10％
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30％，多由于肿瘤局部存在的多种免疫逃逸机制导致，包括肿瘤相关抗原的缺乏，免疫抑制细胞的渗透，免疫抑制肿瘤微环境的限制等，免疫治疗作用十分有限；(2)被动给药的药代动力学不理想，实体瘤内部药物富集率很低，药物的长期使用也可能产生耐药，往往第一剂之后，治疗不响应；(3)缺少主动靶向，导致毒副作用大。CAR
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T疗法虽然在血液瘤中已经取得良好的治疗效果，但对于实体肿瘤治疗仍存在一定局限，其无法高效浸润实体肿瘤内部，且T细胞在肿瘤微环境中遭遇免疫衰竭等因素，使得当前免疫治疗在临床恶性肿瘤治疗中收效不甚理想。
[0004]基于T细胞的浸润情况，肿瘤免疫微环境分为3种不同的表型，分别是免疫沙漠(immune
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desert)型、免疫排斥(immune
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excluded)型和免疫炎症(immune
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inflamed)型，前两种也称为“冷肿瘤”，也就是对免疫检查点抑制剂(CPI)治疗不敏感的非炎症性肿瘤。而最后一种称为“热肿瘤”，免疫炎症表型被T细胞深度浸润，显著响应CPI。“冷肿瘤”的特点包括T细胞浸润程度低、突变负荷低、PD
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L1表达低，而TAMs和Tregs等免疫抑制细胞群被表达，这使得“冷肿瘤“对ICI单抗疗法几乎不反应。
[0005]免疫排斥型对CPI应答率较低，表现出T细胞浸润不良或滞留在肿瘤外。免疫沙漠表型对CPI几乎没有应答，主要是由于肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)中缺乏CD8
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T细胞，反映出缺乏T细胞的启动和生成。这两种肿瘤微环境由于缺乏T细胞或者T细胞无法浸润到实体肿瘤内部，最终导致肿瘤免疫逃逸，CPI治疗效果不佳且个体差异性较大。可见，若要基于免疫检查点理论实现肿瘤免疫治疗的突破进展，首先要解决的就是实体肿瘤的冷热调控。
[0006]当前即便是采用CAR
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T、CAR
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NK等细胞疗法，在临床治疗实体冷肿瘤中仍存在诸多瓶颈。实体瘤通常被隔离于密集的纤维化肿块和缺氧的免疫抑制环境中，这阻碍了CAR
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T、CAR
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NK的细胞浸润；肿瘤微环境中含有许多免疫抑制性细胞和其它免疫抑制因子都会降低
CAR
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T的抗肿瘤效力，同时CAR
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T存在的细胞因子风暴问题，临床应用挑战诸多。
[0007]当前研究对冷热肿瘤的免疫机制逐渐清晰，为针对性地设计治疗策略提供了创新可能。研究表明肿瘤相关巨噬细胞(Tumor associated macrophages，TAM)是形成“T细胞排斥肿瘤表型”的重要决定因素，在小鼠肿瘤研究模型及患者肿瘤中均已发现由于TAM对TME的免疫负调控影响、及其与T细胞等的长期相互作用，CD8
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T细胞很难迁移和侵袭肿瘤巢，无法有效形成T细胞对肿瘤的杀伤作用，这也是“冷肿瘤”临床治疗不响应的根本机制之一。并且更多证据表明，T细胞向肿瘤内的迁移缺陷构成了对癌症免疫治疗的耐药机制。T细胞无法高效侵入实体瘤内部并有效工作，免疫治疗则很难发挥显著作用，最终导致患者生存率低。所以，如何避免肿瘤微环境的T细胞抵抗、实现T细胞高效富集肿瘤并活化激活，从而协同发挥抗肿瘤效应，这是当下免疫治疗亟待解决的问题。
[0008]因此，针对上述免疫治疗的困境，本专利技术设计的针对免疫检查点的冷热肿瘤调控型CAR
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单核/巨噬细胞(CAR
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M)，包括PD
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L1 scFv、α1β1整合素的跨膜区域、α1β1整合素胞内以及FcγR1跨膜信号传导域胞内、GM
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CSF、CCL5细胞招募因子。获得的过继细胞免疫治疗CAR
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M技术，(1)不但可以基于CAR
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M的底盘细胞优势深度递送免疫检查点单链抗体结构域，靶向肿瘤组织并深度浸润实体肿瘤内部特异吞噬肿瘤细胞；(2)GM
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CSF调节TAM介导的肿瘤微环境，同时CCL5招募T细胞等免疫细胞在肿瘤处的有效富集，系统逆转冷肿瘤形成的肿瘤免疫抑制微环境，将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”；(3)胞外抗PD
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L1/PD1结构域解除T细胞的免疫抑制，给予招募来的T细胞充分的杀伤活性。从而使得CAR
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单核/巨噬细胞的特异吞噬及单抗杀伤效应、与肿瘤微环境的逆转及冷热肿瘤的调节效应、T细胞免疫的协同控肿瘤效应相互结合，发挥“立体化”的肿瘤免疫杀伤机制，预期获得显著临床治疗效果。

技术实现思路

[0009]针对上述现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种冷热肿瘤调控型CAR
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单核/巨噬细胞及其制备方法和应用，对以往免疫治疗对冷肿瘤不响应的问题给予根本解决。本专利技术冷热肿瘤调控型CAR
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单核/巨噬细胞可分泌表达CCL5及GM
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CSF，可逆转肿瘤微环境；同时招募T细胞等免疫细胞到达肿瘤部位实现“冷热”转换；同时，抗原结合域包含抗PD
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L1scFv分子或抗PD1 scFv分子，进而增敏T细胞的肿瘤协同杀伤效应。
[0010]本专利技术冷热肿瘤调控型CAR单核/巨噬细胞的作用机制及原理为：
[0011](1)本专利技术冷热肿瘤调控型CAR单核/巨噬细胞可特定分泌粒细胞
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巨噬细胞集落刺激因子(GM
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CSF)，维持自身保持M1表型的同时，可将TAM中M2型抗炎巨噬细胞逆转为M1型促炎巨噬细胞，逆转肿瘤微环境。
[0012](2)进而重塑肿瘤微环境，并且减少对CD8+T侵袭的抑制，营造适宜T细胞的迁移和发挥功能的肿瘤微环境，促进抗肿瘤免疫应答。
[0013](3)同时本专利技术冷热肿瘤调控型CAR单核/巨噬细胞可通过分泌CCL5等本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种冷热肿瘤调控型CAR
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单核/巨噬细胞，其特征在于，所述冷热肿瘤调控型CAR
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单核/巨噬细胞为嵌合抗原受体与单核/巨噬细胞的复合结构，其中嵌合抗原受体包含胞外域、跨膜域和胞内域；所述胞外域包含抗PD
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L1scFv分子或抗PD1scFv分子；所述跨膜域包含α1β1TM；所述胞内域包含α1β1、α1β1与FcγRⅠ共刺激域、可分泌型细胞因子GM
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CSF、招募免疫细胞的细胞因子。2.如权利要求1所述的一种冷热肿瘤调控型CAR
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单核/巨噬细胞，其特征在于，所述招募免疫细胞包括T细胞、NK细胞。3.如权利要求2所述的一种冷热肿瘤调控型CAR
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单核/巨噬细胞，其特征在于，所述招募T细胞或NK细胞的细胞因子包括CCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL14、CCL2、CCL3、CCL4、CCL20、CCL22、IL
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8、IL12、IL
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15、IL
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18。4.如权利要求1所述的一种冷热肿瘤调控型CAR
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单核/巨噬细胞，其特征在于，由包含有抗PD
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L1scFv分子的胞外域、α1β1TM、α1β1与FcγRⅠ共刺激域、可分泌型细胞因子GM
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CSF、CCL5作为招募T细胞的细胞因子，组成的嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。5.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含胞外域、跨膜域和胞内域；胞外域包含抗PD
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L1scFv分子或抗PD1scFv分子；跨膜域包含α1β1TM；胞内域包含α1β1、α1β1与FcγRⅠ共刺激域、可分泌型细胞因子GM
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CSF、招募免疫细胞的细胞因子；优选，招募免疫细胞包括T细胞、NK细胞；更优选，招募T细胞或NK细胞的细胞因子包括CCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL14、CCL2、CCL3、CCL4、CCL20、CCL22、IL
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8、IL12、IL
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15、IL
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【专利技术属性】
技术研发人员：宁蓬勃，
申请(专利权)人：西安电子科技大学，
类型：发明
国别省市：