一种永生化人肺泡Ⅱ型上皮细胞系及其构建方法和用途技术

本发明专利技术属于生物医药学领域，具体公开一种永生化人肺泡Ⅱ型上皮细胞系及其构建方法，该细胞系的保藏号为CCTCC NO:C2022245，携带SV40 T抗原、TTF1基因和c

【技术实现步骤摘要】
一种永生化人肺泡Ⅱ型上皮细胞系及其构建方法和用途


[0001]本专利技术属于生物医药学领域，涉及一种永生化人肺泡Ⅱ型上皮细胞系及其构建方法，以及该细胞系在体外制备人源化肺表面活性物质和该活性物质在治疗各种呼吸窘迫综合征的治疗应用。

技术介绍

[0002]肺泡Ⅱ型上皮细胞是分布于肺泡中的一种重要细胞，其主要功能是分泌肺表面活性物质（Pulmonary Surfactant，PS），在维持肺泡功能和调节肺的血
‑
气交换等方面具有重要生理功能。肺表面活性物质分布于肺泡上皮细胞的表面，是由肺泡的Ⅱ型上皮细胞分泌的脂质和表面活性蛋白组成的复合物，其中约90%为磷脂，约10%为表面活性蛋白。表面活性蛋白包括A、B、C、D四种类型，其中SP
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C为肺泡Ⅱ型上皮细胞所特有，是鉴定肺泡Ⅱ型上皮细胞的重要标志。肺表面活性物质具有降低肺泡表面张力,维持肺泡大小，提高肺泡顺应性，防止肺不张和肺水肿等重要生理功能，对维持肺的功能起到至关重要的作用。
[0003]研究表明，先天性或继发性肺表面活性物质的缺乏或异常是导致呼吸窘迫综合征最重要的发病机制之一，而补充外源性PS在临床上广泛应用于治疗新生儿、儿童及各种病因导致的成人呼吸窘迫综合征，并且获得了很好的疗效，是治疗这类疾病最为有效的药物之一。
[0004]目前国内仅有两种非人源化的PS制剂被批准上市，两种药品均由动物肺组织中提取：一种商品名为固尔苏（Curosurf）（猪肺磷脂注射液），从猪的全肺组织提取；另一种商品名为珂立苏（注射用牛肺表面活性剂），从新生小牛的肺灌洗液中提取。虽然这些从动物提取的PS产品在临床都取得了明显的疗效，但是这些药物都存在几个共同的缺陷:（1）产品中存在的异种蛋白增加治疗过程中患者过敏反应的发生率；（2）患者长期的治疗应用会产生抗PS的抗体，导致这些药物的疗效降低或失去活性；（3）来源于异种动物组织的产品都存在生物安全性的问题。采用常规的生物检疫不仅增加了生产的成本及产品审批的难度，而且也极大限制了产品的市场应用。
[0005]国内外的研究者曾尝试采用半合成PS、人工合成PS和基因重组型PS来替代这些天然提取的PS产品。结果显示，这些半合成的PS、人工合成的PS和基因重组的PS都无法达到天然PS产品所具有的降低表面张力的效果，故这些替代产品至今在市场都没有获得批准应用。因此，制备人源化的天然PS产品将具有独特的临床疗效及市场应用前景。
[0006]肺泡Ⅱ型上皮细胞是合成和分泌肺表面活性物质的唯一组织细胞。由于人的肺泡Ⅱ型上皮细胞来源困难，并且体外培养不能无限增殖，人源化的肺表面活性物质至今没有研发成功，更没有上市产品，因此制备人源化的PS一直是科学家的梦想和临床医生的期望。近年来，随着细胞永生化技术的研究和发展，采用基因转染技术将不增殖或体外增殖力弱的细胞构建成为可体外无限增殖的永生化细胞系成为可能。

技术实现思路

[0007]本专利技术的主要目的是采用基因转染技术建立一种永生化人肺泡Ⅱ型上皮细胞系，并作为体外生产人源化肺表面活性物质的工程细胞，通过体外大规模细胞培养，从培养液中提取和制备人源化肺表面活性物质，该方法是一种生产人源化肺表面活性物质的全新技术方法，采用这种技术方法制备的人源化肺表面活性物质不仅为各种原因导致的呼吸窘迫综合征患者提供有效的治疗方法，而且可以弥补目前国内外市场缺乏人源化肺表面活性物质的一大缺陷。
[0008]为实现以上目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种永生化人肺泡Ⅱ型上皮细胞系，携带SV40 T抗原、TTF1基因和c
‑
Myc基因。
[0009]进一步的，一种永生化人肺泡Ⅱ型上皮细胞系，命名为IHPEC
‑Ⅱ
（Immortalized human type
ꢀⅡꢀ
Pulmonary Epithelial cell line)，已于2022年8月3日保藏在中国典型培养物保藏中心（其简称为CCTCC），其保藏编号为CCTCCNO:C2022245。保藏地址为中国武汉大学，邮政编码430072。
[0010]本专利技术还提供了一种构建永生化人肺泡Ⅱ型上皮细胞系的方法，包括以下步骤：（1）原代人正常肺泡上皮细胞的分离培养；（2）重组载体构建，分别构建携带SV40T抗原、TTF1基因和c
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Myc基因的质粒载体；（3）原代人肺泡细胞的基因转染，在原代培养的人肺泡上进行三个基因的转染；（4）人肺泡Ⅱ型上皮细胞的亚细胞克隆筛选；（5）永生化人肺泡Ⅱ型上皮细胞系的鉴定。
[0011]进一步的，步骤（2）中重组载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体或CRISPR/CAS质粒。优选地，上述重组载体为慢病毒载体。慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因的转导效率，且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因的长期、稳定表达。可以理解，载体的类型并不限于此，可根据具体需要进行调整。此外，载体还可包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子等及其他表达控制元件(例如转录终止信号、或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。
[0012]进一步的，为在工业生产中，大规模生产和获得产品，本专利技术还提供一种体外大规模培养永生化人肺泡Ⅱ型上皮细胞系的方法，包括以下步骤：（1）细胞平面培养：细胞系按照1～5*104/cm2密度接种于细胞工厂中，放于二氧化碳培养箱中培养，待细胞生长至90%汇合时，采用胰蛋白酶溶液消化，收集细胞悬液；（2）细胞微载体三维培养，细胞悬液与预先溶胀灭菌好的微载体悬液按照2～5*105个细胞/ml微载体比例混合后，接种于生物反应器中进行培养，优选培养条件为：温度37℃，溶氧30
‑
65%，pH值7.15
±
0.25，通气量0.2fsl；（3）细胞培养液的连续采集：待微载体上永生化人肺泡Ⅱ型上皮细胞生长至35%饱和后，开始采集细胞培养液。
[0013]作为一个具体的实施例，本专利技术提供了一种产品，由永生化人肺泡Ⅱ型上皮细胞
培养液中制备肺表面活性物质冻干粉，具体制备是通过永生化人肺泡Ⅱ型上皮细胞培养液依次经低温冷藏、解冻、过滤、真空干燥后获得。
[0014]进一步的，该冻干粉可用于制备人源化肺表面活性物质（PS），包括从冻干粉中提取纯化PS后直接作为PS制剂，或与一种或多种药学可接受的组合物组合，制备成表面活性物质制剂，可选的，其组合物可以是药用辅料，如乳糖、氯化钠等；也可以是脂类，所述脂类包括选自磷脂或中性脂类的脂类，任选地所述磷脂选自饱和磷脂和/或不饱和磷脂，任选地所述磷脂选自二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱POPC、二棕榈酰磷脂酰甘油DPPG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种永生化人肺泡Ⅱ型上皮细胞系，其特征在于，携带SV40 T抗原、TTF1基因和c
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Myc基因。2.根据权利要求1所述的一种永生化人肺泡Ⅱ型上皮细胞系，其特征在于，于2022年8月3日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO:C2022245。3.一种构建永生化人肺泡Ⅱ型上皮细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：原代人正常肺泡上皮细胞的分离培养；重组载体构建，分别构建携带SV40 T抗原、TTF1基因及c
‑
Myc基因的质粒载体；原代人肺泡细胞的基因转染，在原代培养的人肺泡上皮细胞上进行三个基因的转染；人肺泡Ⅱ型上皮细胞的亚细胞克隆筛选；永生化人肺泡Ⅱ型上皮细胞系的鉴定。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述重组载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体或CRISPR/CAS质粒。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，重组后携带SV40 T抗原、TTF1基因和c
‑
Myc基因的质粒载体分别为：pRRLsin
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SV40T antigen
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IRES
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Puro、pRRLsin
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TTF1
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IRES
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BSD 、pRRLsin
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c
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Myc
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IRES
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Zeocin。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，原代人肺泡细胞的基因转染包括以下步骤：（1）用携带SV40 T 抗原基因的病毒悬液感染原代人肺泡上皮细胞，培养，并用嘌呤霉素筛选细胞；（2）使用携带TTF...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文健，胡慧青，陈丽，娄晋宁，
申请(专利权)人：苏州冠佲生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：