小麦花药一步成苗培养方法技术

本发明专利技术公开了一种小麦花药一步成苗培养方法，选取小麦花粉细胞发育至单核中期到单核晚期的小麦幼穗，低温（２℃～４℃）预处理２天；经预处理的小麦幼穗，经常规消毒后，剥取花药组织接种在一步成苗培养基上遮光培养；待培养的花药组织出现肉眼可见的愈伤组织时，置于１５００Ｌｘ光照条件下培养一周后，将光照强度增加到３０００Ｌｘ～４０００Ｌｘ，连续培养两周，即可产生根、苗健壮的花粉植株。该方法减少了花粉愈伤组织诱导不定芽和不定根两个必须的技术操作环节，培养成本降低了近５０％，培养天数缩短了４０～５０天，绿苗平均诱导率与多步成苗的绿苗平均诱导率相当，白苗率普遍降低１０个百分点，且试管苗生长健壮、根系发达，根茎连接部位很少或无愈伤组织残留，试管苗移栽成活率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于粮食作物中的小麦细胞工程育种技术，进一步涉及一种小麦 花药一步成苗培养方法。
技术介绍
小麦是人类最重要的粮食作物之一。通过各种途径进行小麦遗传改良是小麦优质、高产、稳产的基础。上世纪70年代发展起来的小麦单倍体育种 技术已成为现代重要的小麦生物技术育种方法之一，在小麦遗传改良中发挥 着重要作用，并培育了一批小麦优良品种，在小麦稳产、高产中发挥了重要 作用。目前，小麦单倍体育种一直使用多步成苗技术，即先在脱分化培养基 上离体培养小麦花药组织诱导花粉细胞脱分化产生愈伤组织，再在再分化培 养基上诱导愈伤组织分化成无根小苗，第三步将诱导的无根小苗转入到生根 培养基上壮苗生根，这一花药培养多步成苗技术存在着培养程序复杂、培养 周期长、费用高、白化苗率高等问题，限制了这一技术的进一推广和应用。 近年来，个别学者进行了小麦花药培养直接出苗研究，但结果很不理想，至 今还没有建立完整的花药培养一步成苗技术。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的问题或不足，本专利技术的目的在于，提供一种小 麦花药一步成苗培养方法，该方法将传统的小麦花药培养多步成苗简化为一 步成苗，以较大幅度的简化小麦花药培养程序，縮短培养周期，降低培养成 本，减少白化苗率，提高花药培养效率和单倍体育种效率。 为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案 一种，其特征在于，包括下列步骤首先选取小麦花粉细胞发育至单核中期到单核晚期的小麦幼穗，于2 。C 4'C条件下低温预处理2天；低温预处理后的小麦幼穗，经常规消毒后，剥取花药组织接种在一步成 苗培养基上，于25。C 27。C条件下遮光培养；所述的一步成苗培养基采用 通用培养基Ww，并以通用培养基Ww为基础，添加以下物质6 —呋喃基氨基嘌呤1.5mg/L， a—奈乙酸0.5mg/L，盐酸硫胺素 8mg/L，酪蛋白500mg/L，生物素0.5mg/L，谷氨酰胺5mg/L，蔗糖 60000mg/L;麦芽糖40000mg/L，琼脂粉5000mg/L;调整一步成苗培养基 pH值为5.6;待培养的花药组织出现肉眼可见的愈伤组织时，置于1500Lx光照条件 下培养一周， 一周后，将光照强度增加到3000Lx 4000Lx，培养温度为25 °C 27°C，连续培养两周，即可产生根、苗健壮的花粉植株。本专利技术的，与传统的小麦花药培养单倍体育 种技术相比，减少了花粉愈伤组织诱导不定芽和不定根两个必须的技术操作 环节，培养成本降低了近50%，培养天数縮短了40 50天，绿苗平均诱导 率与多步成苗的绿苗平均诱导率相当，达到5%左右，最高达到10%。白苗 率普遍降低10个百分点，且试管苗生长健壮、根系发达，根茎连接部位很少或无愈伤组织残留，试管苗移栽成活率高。本专利技术总体提高了小麦花药培 养效率和单倍体育种效率，大大降低了小麦花药培养和单倍体育种成本和时间。附图说明图1是按照本专利技术的小麦花药一步培养成苗方法得到的试管图片，其中 (a)是2007年一步培养成苗的试管图片，(b)是2008年一步培养成苗的 试管图片。以下结合专利技术人给出的实施例对本专利技术作进一步的详细说明。具体实施例方式本专利技术主要通过对花药培养基的改进与使用，将小麦花粉细胞脱分化、 再分化及完整植株的形成过程在一步培养过程中完成，同时不降低或者还一 定程度的提高了培养效率。采用的主要技术手段和措施是1) 选择了无机盐浓度低的通用Wi4培养基作为基本培养基。2) 培养基中的渗透压降低，蔗糖浓度由10%降到6%。3) 添加了麦芽糖(促进绿苗率，降低白苗率)；4) 附加重要的有机物质酪蛋白、生物素和谷氨酰胺，使盐酸硫胺素(VJ 浓度增加到10mg/L。5) 将诱导激素KT与NAA合理搭配。6) 进行了培养前花药组织的低温预处理(2'C 4'C放置2天)。7) 培养过程光条件的调控由散射光到中等光照再到强光照。 本专利技术，包括下列步骤 选取小麦花粉细胞发育至单核中期到单核晚期的小麦幼穗，在2°C 4"C条件下低温预处理2天；预处理后的小麦幼穗经常规消毒后，剥取花药组织接种在一步成苗培养 基上，于25t: 27'C条件下遮光培养。一步成苗培养基选用通用培养基W"，以通用培养基WM为基准，添加以 下物质6 —呋喃基氨基嘌呤(KT): 1.5mg/L， a—奈乙酸(NAA): 0.5mg/L，盐 酸硫胺素(Vbl): 8mg/L，酪蛋白500mg/L，生物素0.5mg/L，谷氨酰胺 5mg/L，蔗糖60000mg/L，麦芽糖40000mg/L，琼脂粉5000mg/L。调整一步成苗培养基的PH值为5.6，置于高压灭菌锅灭菌15分钟 (1.0kg/cm2)。通用培养基Wi4的配方为硝酸钾(KN03): 2000mg/L，磷酸二氢(NH4H2P04): 380 mg/L，氯化钙(CaCl2 *2H20): 140 mg/L，硫酸镁(MgS04 '7H20): 200mg/L，硫酸钾(K2S04): 700mg/L，硫酸亚铁(FeS04 7H20): 27 . 8mg/L， 乙二酸四乙钠(歸DTA): 37. 3mg/L，硫酸锰(MnS04 4H20): 8mg/L，硫酸 锌(ZnS04 *7仏0): 3. Omg/L，硼酸(H3B03): 3. Omg/L，碘化钾(KI): 0. 5mg/L， 钼酸钠(Na2Mo04* 2H20): 0. 005mg/L，硫酸铜(CuS04 5H20): 0. 025mg/L， 氯化钴(CoCl2 6H20): 0. 025mg/L，盐酸硫胺素2mg/L，盐酸吡哆锌0. 5mg/L， 烟酸0.5mg/L，甘氨酸2mg/L。待培养的花药组织出现肉眼可见的愈伤组织时，置1500Lx光照条件下 培养一周， 一周后，将光照强度增加到3000Lx 4000Lx，培养温度为25°C 27°C，连续培养两周，即可产生根、苗健壮的花粉植株。以下是专利技术人给出的实施例-利用本专利技术的小麦花药培养一步成苗方法，专利技术人所在的小麦细胞工程 育种课题组于2007年接种培养共7个杂交组合约30000枚花药，培养时间 50天，直接诱导生根完整绿苗1490株绿苗(图la)，绿苗诱导率4.97%， 诱导白苗180株，白苗率0.6°%。2008年接种培养共5个杂交组合约26000枚花药，培养时间50天，直 接诱导生根完整绿苗1390株绿苗(图lb)，绿苗诱导率5.35%，诱导白苗 193株，白苗率0.7%。培养试剂与传统的方法相比，消耗减少近50%，培 养时间縮短45天左右，白苗率大大降低。图1是按照本专利技术的一步培养成苗方法得到的试管图片，可以看出，试 管苗生长健壮、根系发达，根茎连接部位很少或无愈伤组织残留。权利要求1、一种，其特征在于，包括下列步骤首先选取小麦花粉细胞发育至单核中期到单核晚期的小麦幼穗，在2℃～4℃条件下低温预处理2天；低温预处理后的小麦幼穗，经常规消毒后，剥取花药组织接种在一步成苗培养基上，于25℃～27℃条件下遮光培养；所述的一步成苗培养基采用通用培养基W14，并以通用培养基W14为基准，添加以下物质6-呋喃基氨基嘌呤1.5mg/L，α-奈乙酸0.5mg/L，盐酸硫胺素8mg/L，酪蛋白500mg/L，生物素0.5mg/L，谷氨酰胺5mg/L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小麦花药一步成苗培养方法，其特征在于，包括下列步骤：　首先选取小麦花粉细胞发育至单核中期到单核晚期的小麦幼穗，在２℃～４℃条件下低温预处理２天；　低温预处理后的小麦幼穗，经常规消毒后，剥取花药组织接种在一步成苗培养基上，于２ ５℃～２７℃条件下遮光培养；　所述的一步成苗培养基采用通用培养基Ｗ１４，并以通用培养基Ｗ１４为基准，添加以下物质：　６－呋喃基氨基嘌呤：１．５ｍｇ／Ｌ，α－奈乙酸：０．５ｍｇ／Ｌ，盐酸硫胺素：８ｍｇ／Ｌ，酪蛋白：５００ｍｇ／Ｌ， 生物素：０．５ｍｇ／Ｌ，谷氨酰胺：５ｍｇ／Ｌ，蔗糖：６００００ｍｇ／Ｌ；麦芽糖：４００００ｍｇ／Ｌ，琼脂粉：５０００ｍｇ／Ｌ；调整一步成苗培养基ｐＨ值为５．６；　待培养的花药组织出现肉眼可见的愈伤组织时，置于１５００Ｌｘ光照条件下培养 一周，一周后，将光照强度增加到３０００Ｌｘ～４０００Ｌｘ，培养温度为２５℃～２７℃，连续培养两周，即可产生根、苗健壮的花粉植株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈耀锋，李春莲，任慧莉，郭东伟，白延红，刘丽，吕瑞华，李得孝，胡甘，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]