一种基于探针捕获靶向测序技术的混样检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种基于探针捕获靶向测序技术的混样检测方法及应用，所述方法将两种及以上不同物种的DNA及液相育种芯片混合，可实现仅一次文库构建检出两种及以上不同物种来源的样本文库，简化了实验操作流程，提高了建库效率，使得单个样本的文库构建及杂交捕获的成本极大降低，若进行两个样本混合构建，将节省50％的建库成本，若进行4个样本混合，将节省75％的建库成本。75％的建库成本。

【技术实现步骤摘要】
一种基于探针捕获靶向测序技术的混样检测方法及应用


[0001]本专利技术属于基因检测领域，具体涉及一种基于探针捕获靶向测序技术的混样检测方法及应用。

技术介绍

[0002]近年来随着分子检测技术的进步，高通量测序已成为生物学领域的一种重要技术手段，虽然全基因组测序和全外显子测序能提供高效便捷的数据产出，但其高昂的检测成本和海量数据处理仍然面对巨大的挑战；因此为了降低成本和数据量，使用相对低成本、高通量的靶向测序技术来检测基因突变已成为一种趋势。
[0003]液相探针杂交捕获技术是靶向测序中定位中高通量的一个关键性技术，是利用不同的分子生物学方法降低基因组的复杂性，可对客户感兴趣的区域实现精准捕获，目前已广泛应用多个物种，如猪50K芯片、大麦40K芯片、鲍40K芯片等。虽然靶向测序技术相较重测序价格已经大幅度降低，但根据现有复杂的建库手段以及试剂耗材成本，其检测成本相对于大批量的育种群体而言，仍然是不小的挑战，因此仍需创新的靶向测序检测方法，以降低成本，进一步提高靶向测序检测方法的优势。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种基于探针捕获靶向测序技术的混样检测方法。
[0005]本专利技术还提出上述方法的应用。
[0006]根据本专利技术的一个方面，提出了一种基于探针捕获靶向测序技术的混样检测方法，包括以下步骤：
[0007]S1、将不同物种基因组DNA混合后进行片段化，得到片段化的基因组DNA；
>[0008]S2、将所述片段化的基因组DNA进行3
’
末端加A尾，得到末端修复产物；
[0009]S3、将所述末端修复产物连接接头，得到连接有接头的末端修复产物；
[0010]S4、以所述连接有接头的末端修复产物为模板，进行PCR扩增反应，得到DNA文库；
[0011]S5、将用于检测不同物种的探针进行混合，得到探针混合溶液；
[0012]S6、将步骤S4得到的DNA文库和步骤S5的探针混合溶液进行文库杂交反应，捕获目标DNA片段；
[0013]S7、将捕获的目标DNA片段进行PCR扩增反应，得到富集的文库；
[0014]S8、对富集的文库进行测序。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，所述不同物种基因组DNA来源于无脊椎动物和脊椎动物。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，所述脊椎动物包括圆口类、鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类动物。
[0017]在本专利技术的一些实施方式中，所述哺乳类动物包括人类、牛。
[0018]在本专利技术的一些实施方式中，所述鱼类包括凡纳滨对虾。
[0019]在本专利技术的一些实施方式中，所述不同物种基因组DNA为≥2个物种的基因组DNA。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中，不同物种基因组DNA进行混合的添加质量比为按照不同物种基因组DNA的数据量的比值进行添加。
[0021]在本专利技术的一些实施方式中，不同物种基因组DNA的总质量为180～220ng。
[0022]在本专利技术的一些实施方式中，所述片段化的方式为超声随机打断、转座酶酶切或限制性内切酶切。
[0023]在本专利技术的一些实施方式中，还包括将连接有接头的末端修复产物进行纯化的步骤。
[0024]在本专利技术的一些实施方式中，所述纯化采用磁珠进行。
[0025]在本专利技术的一些实施方式中，步骤S4中所述PCR扩增反应体系为：
[0026]试剂用量HiFi Amplification Mix25μLI5(MGI 15uM)2.5μLI7(MGI 15uM)2.5μLDNA模板总量20μL总共50μL
[0027]在本专利技术的一些实施方式中，步骤S4中所述PCR扩增反应程序为：
[0028][0029][0030]在本专利技术的一些实施方式中，步骤S4中所述PCR扩增反应程序还包括105℃热盖的步骤。
[0031]在本专利技术的一些实施方式中，还包括对DNA文库进行纯化的步骤。
[0032]在本专利技术的一些实施方式中，所述纯化采用磁珠进行。
[0033]在本专利技术的一些实施方式中，还包括对DNA文库进行质控的步骤。
[0034]在本专利技术的一些实施方式中，不同物种的探针的添加质量比为(1～2)：(1～3)。
[0035]在本专利技术的一些实施方式中，不同物种的探针的添加质量比为1:1。
[0036]在本专利技术的一些实施方式中，所述探针的添加量为1～4pmol/mL。
[0037]在本专利技术的一些实施方式中，所述探针混合液中TE缓冲液。
[0038]在本专利技术的一些实施方式中，所述TE缓冲液中包括EDTA和Tris
‑
HCl。
[0039]在本专利技术的一些实施方式中，所述EDTA的浓度10mM，pH为8.0。
[0040]在本专利技术的一些实施方式中，所述Tris
‑
HCl的浓度为1mM，pH为8.0。
[0041]在本专利技术的一些实施方式中，还包括对不同物种的探针序列交叉基因组进行比对，确定无同源序列的步骤。
[0042]在本专利技术的一些实施方式中，所述文库杂交反应的体系为：文库10μL、探针混合溶液2μL、2
×
Hyb Buffer 15μL和human Cot
‑
1 DNA 2.5μL。
[0043]在本专利技术的一些实施方式中，所述捕获目标DNA片段的方式采用捕获磁珠进行捕获。
[0044]在本专利技术的一些实施方式中，所述得到富集的文库前，进行的PCR扩增反应的体系为：文库48μL、Post PCR Master Mix 50μL和Post PCR Primer 2μL。
[0045]在本专利技术的一些实施方式中，所述得到富集的文库前，进行的PCR扩增反应的程序为：
[0046][0047][0048]在本专利技术的一些实施方式中，所述PCR扩增反应程序还包括105℃热盖的步骤。
[0049]在本专利技术的一些实施方式中，所述富集的文库在测序前还包括纯化的步骤。
[0050]在本专利技术的一些实施方式中，所述纯化采用磁珠进行。
[0051]在本专利技术的一些实施方式中，所述测序采用华大测序仪进行PE150测序。
[0052]在本专利技术的一些实施方式中，测序得到的数据还包括质控处理和生信分析步骤，质控处理和生信分析步骤如下：原始数据经过质控过滤处理，去除含有接头污染的Reads和低质量的Reads，应用BWA软件与参考基因组进行比对，再利用GATK软件对测序结果进行变异位点分析。
[0053]根据本专利技术的第二方面，提出了上述方法在基因分型检测中的应用。
[0054]根据本专利技术的一些实施方式，至少具有以下有益效果：本专利技术基于探针捕获靶向测序技术的混样检测方法，将两种及以上不同物种的DNA及液相育种芯片混合，可实现仅一次文库构建检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于探针捕获靶向测序技术的混样检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将不同物种基因组DNA混合后进行片段化，得到片段化的基因组DNA；S2、将所述片段化的基因组DNA进行3
’
末端加A尾，得到末端修复产物；S3、将所述末端修复产物连接接头，得到连接有接头的末端修复产物；S4、以所述连接有接头的末端修复产物为模板，进行PCR扩增反应，得到DNA文库；S5、将用于检测不同物种的探针进行混合，得到探针混合溶液；S6、将步骤S4得到的DNA文库和步骤S5的探针混合溶液进行文库杂交反应，捕获目标DNA片段；S7、将捕获的目标DNA片段进行PCR扩增反应，得到富集的文库；S8、对富集的文库进行测序。2.根据权利要求1所述的混样检测方法，其特征在于，所述不同物种基因组DNA来源于无脊椎动物和脊椎动物；优选地，所述脊椎动物包括圆口类、鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类动物。3.根据权利要求1所述的混样检测方法，其特征在于，不同物种基因组DNA进行混合的添加质量比为按照不同物种基因组DNA的数据量...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷雨婷，肖金华，田冰川，唐顺学，曹桂元，
申请(专利权)人：华智生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：