一种用于厚皮甜瓜杂交品种纯度鉴定的SSR引物组及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于厚皮甜瓜杂交品种纯度鉴定的SSR引物组及其应用，属于厚皮甜瓜杂交种子纯度鉴定技术领域。所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
一种用于厚皮甜瓜杂交品种纯度鉴定的SSR引物组及其应用


[0001]本专利技术属于厚皮甜瓜杂交种子纯度鉴定
，尤其涉及一种用于厚皮甜瓜杂交品种纯度鉴定的SSR引物组及其应用。

技术介绍

[0002]种子纯度是衡量种子质量优劣的一项关键指标，甜瓜种子大多数为杂交种，在甜瓜杂交种繁殖过程中，由于去雄不彻底或花粉混杂污染、昆虫传粉等原因，使得杂交种纯度下降，种子纯度降低会显著降低作物的产量和产品品质，使农民蒙受巨大的经济损失，也制约产业的快速发展。因此，在制种后和销售前对甜瓜F1代杂种子进行纯度鉴定是必不可少的。
[0003]目前甜瓜杂交种纯度的鉴定多采用田间种植检验方法，不仅费工耗时，用地多，且容易受季节、环境因素影响，另外有些性状肉眼难以区分，从而降低鉴定结果的可靠性。随着分子生物学技术的快速发展，品种的纯度检测工作也深入到基因水平。SSR(Simple SequenceRepeat)分子标记又称为微卫星DNA标记，即简单序列重复，SSR分子标记具有重复性好、多态性高、共显性分离、操作简单等优点，可高效、准确区分父、母本及杂交种的带型，在茄子、葡萄、花生、甘薯、水稻、玉米、番茄等种子的纯度鉴定上得到广泛应用。
[0004]蜜语佳网、丰登蜜25、甬甜7号、银蜜58、丰登蜜1号、丰蜜29和甬甜5号是宁波市农业科学研究院蔬菜研究所自主选育的厚皮甜瓜杂交一代品种，具有高糖、高产、抗病性好等特色，深受甜瓜农户欢迎。目前需探索一种可以简单、快速、准确且不受季节气候限制的品种纯度鉴定方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一在于提供一种用于厚皮甜瓜杂交品种纯度鉴定的SSR引物组，所述引物组的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1
‑
8所示。
[0006]优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1
‑
2所示的SSR1引物用于鉴定蜜语佳网的种子纯度；所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3
‑
4所示的SSR2引物用于鉴定丰登蜜25的种子纯度；所述核苷酸序列如SEQ ID NO.5
‑
6所示的SSR3引物用于鉴定甬甜7号和银蜜58的种子纯度；所述核苷酸序列如SEQ ID NO.7
‑
8所示的SSR4引物用于鉴定丰登蜜1号、丰蜜29和甬甜5 号的种子纯度。
[0007]本专利技术地目的之二在于提供上述SSR引物组在鉴定厚皮甜瓜杂交品种纯度中的应用。
[0008]优选地，所述应用步骤为：
[0009](1)从甜瓜种子的下胚轴中提取甜瓜基因组DNA；
[0010](2)以甜瓜基因组DNA为模板，采用权利要求1中的引物进行PCR扩增，得扩增产物；
[0011](3)将扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳检测；
[0012](4)对电泳结果进行分析，比较供试杂交种及其父母本的特征条带，当母本表现为
4～52：甬甜7号杂交种)，方框代表与母本带型一致的假杂种；
[0029]图4是实施例1银蜜58厚皮甜瓜种子纯度鉴定中利用引物SSR3扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱(M：DL 2000bp Marker分子量标准；P1：银蜜58母本，P2：银蜜58父本； 4～52：银蜜58杂交种)；
[0030]图5是实施例1丰登蜜1号厚皮甜瓜种子纯度鉴定中利用引物SSR4扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱(M：DL 2000bp Marker分子量标准；P1：丰登蜜1号母本，P2：丰登蜜1 号父本；4～52：丰登蜜1号杂交种)，方框代表与母本带型一致的假杂种；
[0031]图6是实施例1丰蜜29厚皮甜瓜种子纯度鉴定中利用引物SSR4扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱(M：DL 2000bp Marker分子量标准；P1：丰蜜29母本，P2：丰蜜29父本； 4～52：丰蜜29杂交种)；
[0032]图7是实施例1甬甜5号厚皮甜瓜种子纯度鉴定中利用引物SSR4扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱(M：DL 2000bp Marker分子量标准；P1：甬甜5号母本，P2：甬甜5号父本； 4～52：甬甜5号杂交种)，方框代表与母本带型一致的假杂种。
具体实施方式
[0033]以下实施例中提到的蜜语佳网、丰登蜜25、甬甜7号、银蜜58、丰登蜜1号、丰蜜29 和甬甜5号都可从宁波丰登种业公司购买到。
[0034]实施例1
[0035]本实施例提供一种用于鉴定蜜语佳网、丰登蜜25、甬甜7号、银蜜58、丰登蜜1号、丰蜜29和甬甜5号厚皮甜瓜杂交种子纯度的SSR引物及方法：
[0036](1)甜瓜基因组DNA的提取与检测：
[0037]选择籽粒饱满且大小一致的蜜语佳网、丰登蜜25、甬甜7号、银蜜58、丰登蜜1号、丰蜜29和甬甜5号甜瓜杂交种各100粒和亲本(母本和父本)种子各1粒，在50℃清水中直至冷却至室温，浸种2h，然后用湿润毛巾包裹置于30℃恒温培养箱中保湿催芽，待下胚轴生长至2cm左右时，剪下每粒种子的下胚轴分别置于2ml离心管中研磨成浆，加入1000μL 的CTAB提取液，65℃水浴15min，期间颠倒混匀2～3次。加入1000μL的氯仿，剧烈震荡，在12000r/min下离心10min，重复2次，取上清液至新的离心管中，加入2倍体积无水乙醇进行沉淀，12000r/min下离心10min，弃上清，用75％乙醇溶液洗涤沉淀，12000r/min 下离心5min后弃去上清，晾干底部沉淀，加入50μL去离子水，充分溶解后用Nanodrop2000 超微量分光光度计检测DNA质量。
[0038](2)PCR扩增及检测
[0039]PCR扩增采用的反应体系包括：浓度为100ng/μL的甜瓜基因组DNA1μL，10
×
PCR buffer2.5μL，2.5mM的dNTPs 0.5μL，20μmol/L的正向引物0.5μL、20μmol/L的反向引物0.5μL， 2UTaq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O补足至25μL，在PCR仪中进行扩增。扩增程序为：94℃预变性5min后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃终延伸5min，置于4℃保存。对PCR扩增产物采用加有溴化乙锭(EB)质量百分含量为3％的琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为1
×
TAE缓冲液，电压为150V。电泳结束后在凝胶成像分析仪中观察电泳条带，扫描图像并保存。
[0040](3)步骤(2)中所用引物的具体核苷酸序列如下：
[0041]SSR1
‑
R：5
’‑
GGGTGGATTCACTATTTCC
‑3’
(SEQ ID NO.1)；
[0042]SSR1
‑
R：5
’‑
TTAATCTGGCCGCTTATAC
‑3’
(SEQ ID NO.2)；
[0043]SSR2
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于厚皮甜瓜杂交品种纯度鉴定的SSR引物组，其特征在于，所述引物组的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1
‑
8所示。2.根据权利要求1所述的SSR引物组，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1
‑
2所示的SSR1引物用于鉴定蜜语佳网的种子纯度；所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3
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4所示的SSR2引物用于鉴定丰登蜜25的种子纯度；所述核苷酸序列如SEQ ID NO.5
‑
6所示的SSR3引物用于鉴定甬甜7号和银蜜58的种子纯度；所述核苷酸序列如SEQ ID NO.7
‑
8所示的SSR4引物用于鉴定丰登蜜1号、丰蜜29和甬甜5号的种子纯度。3.权利要求2所述的SSR引物组在鉴定厚皮甜瓜杂交品种纯度中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用步骤为：(1)从甜瓜种子的下胚轴中提取甜瓜基因组DNA；(2)以甜瓜基因组DNA为模板，采用权利要求1中的引物进行PCR扩增，得扩增产物；(3)将扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳检测；(4)对电泳结果进行分析，比较供试杂交种及其父母本的特征条带，当母本表现为1条特征条带，父本表现为相异于母本的1条特征条带，纯合的杂交种即表现为这2条特征条带的集合，则为真正杂交种，缺少其中任意一条条带的为假杂种。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中PCR扩增采用的反应体系包括：浓度为100ng/μL的甜瓜基因组DNA 1μL，10
×
PCRbuffer 2.5μL，2.5mM的dNTPs 0.5μL，20μmol/L的正向引物0.5μL、20μmol/L的反向引物0.5μL，2U Taq DNA聚合...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝芳敏，臧全宇，丁伟红，马二磊，黄芸萍，王毓洪，
申请(专利权)人：宁波市农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：