一种代谢工程改造大肠杆菌及其在发酵制备酪醇中的应用制造技术

本发明专利技术以大肠杆菌W3110为底盘细胞，通过代谢改造，得到L

【技术实现步骤摘要】
一种代谢工程改造大肠杆菌及其在发酵制备酪醇中的应用


[0001]本专利技术涉及一种代谢工程改造大肠杆菌发酵制备酪醇的方法，属于生物


技术介绍

[0002]酪醇(4
‑
羟基苯乙醇，Tyrosol，C8H
10
O2)是一种天然多酚，是苯乙醇的一种衍生物。主要存在于女贞和橄榄油中，具有抗氧化、抗癌、抗抑郁、抗骨质疏松、抗炎、心脏保护和神经保护等多种药理作用。其需求量与日俱增。目前主要有三种不同的方法已被用于生产酪醇，包括直接从植物或细胞组织培养物中提取、化学合成法、微生物合成法。植物来源中酪醇的丰度低，提取过程复杂，导致产能相对较低，成本较高。另一方面，化学方法需要相对极端的反应条件，可能会造成严重的环境污染。微生物法合成酪醇因具有周期短和易调控等特点更有优势。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种通过代谢改造得到无质粒高产L
‑
酪氨酸菌株，并以此为基础通过重组外源基因，获得能够生产酪醇的基因工程菌。该基因工程菌能够高产量生产酪醇。
[0004]本专利技术的第一个目的是提供一种生产酪氨酸的重组大肠杆菌，所述的重组大肠杆菌以大肠杆菌W3110为底盘菌，通过代谢改造，得到高产L
‑
酪氨酸的大肠杆菌WTY8菌株。再以大肠杆菌WTY8为宿主菌在重组质粒上pTrc99a上表达香芹来源的芳香醛合酶(PcAAS)基因。得到酪醇生产菌株。
[0005]本专利技术的第二个目的是提供了酪醇生产重组菌株发酵生产酪醇的方法。
[0006]为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种基因工程菌WTY8，所述基因工程菌WTY8是对大肠杆菌W3110进行如下改造获得的：敲除tyrR基因、pykF基因、trpD基因和pheA基因；将galP基因的启动子、glk基因的启动子、ppsA基因的启动子和tyrA基因的启动子分别替换为trc启动子；将编码如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的tyrA基因突变为编码如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的tyrA
fbr
基因。(即将tyrA蛋白第53位氨基酸由蛋氨酸突变为异亮氨酸，tyrA蛋白第354位氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸)。
[0008]在本专利技术的一个实施例中利用CRISPR/Cas 9技术对大肠杆菌W3110进行改造得到酪氨酸高产菌株WTY8，将重组质粒转化到WTY8菌株中，得到酪醇生产菌株。
[0009]第二方面，本专利技术还提供一种上述基因工程菌WTY8在生产酪氨酸中的应用。既可以在实验室摇瓶生产，也可以在工厂中利用发酵罐生产。
[0010]在本案的一个实施例中，所述应用为：
[0011]将所述基因工程菌WTY8接种于LB液体培养基，37℃、180rpm培养12h，得到种子液；所述种子液按1％的体积接种量接入到新鲜LB液体培养基，37℃、180rpm培养，当OD600＝
0.8时，加入终浓度为0.1mM IPTG，20℃、180rpm条件下，诱导培养14h；将所得诱导后菌液离心(4000rpm，5min)，所得湿菌体转入发酵培养基中，30℃，180rpm培养48h，得到L
‑
酪氨酸。
[0012]所述发酵培养基包括葡萄糖。
[0013]在本专利技术的一个实施例中，所述新鲜LB液体培养基与所述发酵培养基的体积比为1:1
‑
2。
[0014]第三方面，本专利技术还提供一种上述基因工程菌WTY8在生产酪醇中的应用，所述应用为：将包含Trc启动子和芳香醛合酶基因的重组表达质粒导入所述基因工程菌WTY8，所得WTYS1菌株经发酵培养生产酪醇。
[0015]该基因用于将酪氨酸转化为酪醇。
[0016]进一步，所述芳香醛合酶(GenBank：AAA33860.1)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，更进一步，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0017]所述重组表达质粒的载体可以为各种本领域适用于大肠杆菌表达体系的常规载体，在本专利技术的一个实施例中为pTrc99a。
[0018]具体地，在本专利技术的一个实施例中，所述重组表达质粒为将如SEQ ID NO:1所示所示基因片段构建在pTrc99a载体的PstⅠ及DraⅢ限制性核酸酶酶切位点之间获得。
[0019]具体地，本专利技术提供两种应用的方法，摇瓶和发酵罐。第一种，所述应用(摇瓶)为：将所述重组表达质粒转入所述基因工程菌WTY8中，经平板筛选，所得阳性克隆即为基因工程菌WTYS1；将所述基因工程菌WTYS1接种至含与所述表达质粒抗性相应抗生素的LB固体培养基上培养，得到单菌落，
[0020]挑取单菌落接种到含与所述表达质粒抗性相应抗生素的LB液体培养基中37℃、180rpm条件下培养12h获得种子液，所述种子液以1％的体积接种量接入新鲜的含抗生素的LB液体培养基，在37℃、180rpm条件下培养至OD600＝0.8时加入终浓度为0.1mM的IPTG，在20℃下诱导培养14h，离心收集菌体，所得湿菌体转入发酵培养基中于30℃、180rpm发酵48h生产酪醇。
[0021]进一步，所述发酵培养基的终浓度组成为：葡萄糖20g/L，酵母提取物2g/L，KH2PO
4 1g/L，MgSO4·
7H2O 0.5g/L，(NH4)2SO
4 16g/L，CaCO
3 5g/L，MnSO
4 0.01g/L，FeSO
4 0.01g/L，溶剂为水，pH自然。
[0022]采用上述重组大肠杆菌发酵生产酪醇。
[0023]既可以在实验室摇瓶生产，也可以在工厂中利用发酵罐生产。
[0024]在本案的一个实施例中，所述应用为(发酵罐发酵条件)：将所述重组表达质粒转入所述基因工程菌WTY8中，经平板筛选，所得阳性克隆即为基因工程菌WTYS1；将所述基因工程菌WTYS1接种到含与所述表达质粒抗性相应抗生素的LB液体培养基中37℃、180rpm条件下培养14h获得第一阶段种子液，按1％体积接种量接入新鲜含与所述表达质粒抗性相应抗生素的LB液体培养基中，于37℃、180rpm培养14h，所得第二阶段种子液按照10％体积接种量转入装有发酵培养基的发酵罐中，通气量1VVM，于37℃培养，至OD600达到10时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，20℃下诱导培养14h后加入终浓度为20g/L葡萄糖，30℃下发酵100h，发酵过程中补加葡萄糖和酵母粉，使葡萄糖浓度维持在5
‑
10g/L。
[0025]所述发酵培养基：胰蛋白胨15g/L，酵母提取物5g/L，Na2HPO4·
12H2O 15.12g/L，KH2PO
4 3g/L，MgSO4·
7H2O 0.5g/L，CaCl
2 0.011g/L，NH4Cl 1g/L，溶剂为水，pH自然。
[0026]发酵罐葡萄糖补料：葡萄本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌WTY8，其特征在于：所述基因工程菌WTY8是对大肠杆菌W3110进行如下改造获得的：敲除tyrR基因、pykF基因、trpD基因和pheA基因；将galP基因的启动子、glk基因的启动子、ppsA基因的启动子和tyrA基因的启动子分别替换为trc启动子；将编码如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的tyrA基因突变为编码如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的tyrA
fbr
基因。2.如权利要求1所述的基因工程菌WTY8，其特征在于所述改造利用CRISPR/Cas9技术进行。3.如权利要求1所述的基因工程菌WTY8在生产酪氨酸中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述基因工程菌WTY8接种于LB液体培养基，37℃、180rpm培养12h，得到种子液；所述种子液按1％的体积接种量接入到新鲜LB液体培养基，37℃、180rpm培养，当OD600＝0.8时，加入终浓度为0.1mM IPTG，20℃、180rpm条件下，诱导培养14h；将所得诱导后菌液离心，所得湿菌体转入发酵培养基中，30℃，180rpm培养48h，得到L
‑
酪氨酸。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述新鲜LB液体培养基与所述发酵培养基的体积比为1:1
‑
2。6.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，姜梦超，赵嫚，金黎媛，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：