利用Cas12i在大豆中进行基因编辑的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用Cas12i在大豆中进行基因编辑的方法，所述方法包括利用Cas12i和gRNA在大豆中进行基因编辑的步骤，所述gRNA包括与Cas12i结合的骨架区以及与靶序列杂交的引导序列，所述gRNA靶向大豆的GmFAD2

【技术实现步骤摘要】
利用Cas12i在大豆中进行基因编辑的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及在大豆中进行基因编辑的方法，尤其涉及利用Cas12i在大豆中进行基因编辑的方法。

技术介绍

[0002]大豆是人类主要油脂和蛋白质的来源，是世界最重要的经济作物之一，也是人类植物油和植物性蛋白的主要来源。随着生活水平的提高以及饮食结构的改善，人们对优质大豆油的需求日益增长，培育高品质大豆成为大豆育种的重要目标之一。
[0003]CRISPR/Cas9系统是最常用的II型CRISPR系统，它识别3
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NGG的PAM基序，对靶标序列进行平末端切割。通过向导RNA的介导和Cas9蛋白的切割来实现对靶基因的定点编辑。该技术不仅对基因功能的研究提供了新思路，更广泛的应用于生物医药的研发和农作物的遗传改良等领域。目前，CRISPR/Cas9系统已经成功应用在拟南芥、水稻、玉米、小麦、大豆等植物中。
[0004]CRISPR/Cas Type V系统是一类新发现的CRISPR系统，它具有5
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TTN的基序，对靶标序列进行粘性末端切割，例如Cpf1,C2c1,CasX,CasY。然而目前存在的不同的CRISPR/Cas各有不同的优点和缺陷。例如Cas9,C2c1和CasX均需要两条RNA进行指导RNA，而Cpf1只需要一条指导RNA而且可以用来进行多重基因编辑。CasX具有980个氨基酸的大小，而常见的Cas9，C2c1，CasY和Cpf1通常大小在1300个氨基酸左右。此外，Cas9，Cpf1，CasX，CasY的PAM序列都比较复杂多样，而C2c1识别严谨的5
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TTN，因此它的靶标位点比其他系统容易被预测从而降低了潜在的脱靶效应。
[0005]Cas12i也属于V型CRISPR/Cas系统，中国专利(CN111757889B，公告日期：20210525)公开了一种V型Cas酶(Cas12f.4)，在本专利技术中，将Cas12f.4定义为Cas12i。如CN111757889B记载可知，该Cas酶(Cas12f.4)对于单子叶植物玉米表现出了一定的编辑活性，但是，大豆不同于玉米，属于双子叶植物。专利技术人研究该酶在双子叶植物(例如，拟南芥、大豆等植物)的编辑活性时，发现该酶针对双子叶植物的编辑效率较低，甚至在某些位点无法体现出编辑活性。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的是提供一种利用Cas12i在大豆中进行基因编辑的方法。
[0007]一方面，本专利技术提供了利用Cas12i在大豆中进行基因编辑的方法，所述方法包括利用Cas12i和gRNA在大豆中进行基因编辑的步骤，所述gRNA靶向区域大豆的GmFAD2
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1A基因和GmFAD2
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1B基因。
[0008]在一个实施方式中，所述Cas12i的氨基酸序列选自以下I
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III任一种：
[0009]I、Cas12i的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性，并且基本保留了SEQ ID No.1的生物学功能；
[0010]II、Cas12i的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺
失或添加的序列(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加)，并且基本保留了SEQ ID No.1的生物学功能；
[0011]III、Cas12i包含SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或Cas12i的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0012]在一个实施方式中，所述Cas12i的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，在对应于SEQ ID No.1所示序列的第369位氨基酸和第433位氨基酸处发生突变；优选的，第369位氨基酸突变为精氨酸(Arg，R)，第433位氨基酸突变为精氨酸(Arg，R)。上述Cas12i为突变的Cas12i，其为SEQ ID No.1第369位氨基酸和第433位氨基酸同时发生突变(均突变为R)的突变蛋白，上述突变的Cas12i蛋白与SEQ ID No.1所示的野生型Cas12i相比，显著的提高了编辑活性。
[0013]在一个实施方式中，所述gRNA包括第一区段和第二区段；所述第一区段又称为“骨架区”、“蛋白质结合区段”、“蛋白质结合序列”、或者“同向重复(Direct Repeat)序列”；所述第二区段又称为“靶向核酸的靶向序列”或者“靶向核酸的靶向区段”，或者“靶向靶序列的引导序列”。
[0014]所述gRNA的第一区段、“骨架区”、“蛋白质结合区段”、“蛋白质结合序列”、或者“同向重复序列”能够与本专利技术的Cas12i蛋白相互作用，从而使Cas12i蛋白和gRNA形成复合物。本专利技术gRNA经过靶向核酸的靶向序列的作用将其相互作用的Cas12i蛋白引导至靶核酸内的特异性核苷酸序列。
[0015]本专利技术靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段包含与靶核酸中的序列互补的核苷酸序列。换言之，本专利技术靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段经过杂交(即，碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用。因此，靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段可改变，或可被修饰以杂交靶核酸内的任何希望的序列。
[0016]优选的，所述gRNA从5
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至3
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方向包含第一区段和第二区段。
[0017]本专利技术中，所述第二区段还可以理解为与靶序列杂交的引导序列。
[0018]在一个实施方式中，所述gRNA中靶向靶序列的引导序列为ccucauugcauggccaaucuauu(SEQ ID No.2)；所述gRNA中的同向重复序列为agagaaugug ugcauagucacac(SEQ ID No.3)或cucugaccac cugagagaau gugugcauag ucacacggua uaacaacuuc gacgagcucu(SEQ ID No.4)。
[0019]在其他的实施方式中，所述gRNA的同向重复序列在SEQ ID No.3的基础上，还可以具有碱基缺失、取代或添加，只要其能保证与Cas12i的结合能力即可，例如，中国专利申请(CN113337502A)中记载的“agagaaugugugcauagucaacac”、“agagaaugugugcauagucuacac”、“agagaaugugugcauaguccacac”或“agagaaugugugcauagucgacac”。
[0020]在一个实施方式中，本专利技术的基因编辑的方法包括向大豆植物细胞、大豆种子、大豆植物、大豆植物组织或大豆植物部分中递送Cas12i和gRNA的步骤。
[0021]上述递送可采用本领域已知的任何方法进行递送。此类方法包括但不限于，转化、转染、电穿孔、脂转染、显微注射、声孔效应、基因枪、磷酸钙介导的转染、阳离本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用Cas12i在大豆中进行基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括利用Cas12i和gRNA在大豆中进行基因编辑的步骤，所述gRNA包括与Cas12i结合的骨架区以及与靶序列杂交的引导序列，所述gRNA靶向大豆中的GmFAD2
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1A基因和GmFAD2
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1B基因；所述Cas12i的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，在对应于SEQ ID No.1所示序列的第369位氨基酸和第433位氨基酸处发生突变。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第369位氨基酸突变为R，所述第433位氨基酸突变为R。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述gRNA中与靶序列杂交的引导序列如SEQ ID No.2所示。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括向大豆植物细胞、大豆种子、大豆植物、大豆植物组织或大豆植物部分中递送所述Cas12i和gRNA的步骤。5.一种载体系统，所述载体系统包括一种或多种载体，该一种或多种载体包括：a)第一调控元件和权利要求1
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4任一权利要求中的gRNA，所述第一调控元件可操作地与所述gRNA连接，b)第二调控...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢洪涛，段志强，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：