SARS-COV-2抑制剂制造技术

公开了SARS

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】SARS
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COV
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2抑制剂
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年7月14日提交的美国临时专利申请序列号63/051,474和2020年8月19日提交的美国临时专利申请序列号63/067,593的优先权，所述美国临时专利申请序列号均全文以引用方式并入本文。
[0003]联邦资助声明
[0004]本专利技术是根据在由国防高级研究计划局(Defense Advanced Research Projects Agency)授予的批注号FA8750
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17
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C
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0219和由国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的批注号HHSN272201700059C和R01 GM120553下的政府支持完成的。政府对本专利技术具有一定权利。
[0005]序列表声明：
[0006]序列表的计算机可读形式通过电子递交方式与本申请一同提交，并且通过引用以其整体并入本申请中。序列表包含在2021年5月25日创建的文件中，文件名为“20
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1074
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WO_SeqList_ST25”并且大小为1,112kb。

技术介绍

[0007]SARS
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CoV
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2感染被认为往往从鼻子开始，病毒在那里复制数次，然后传播到更广泛的呼吸系统。因此，将高浓度的病毒抑制剂递送到鼻子和呼吸系统中通常可以潜在地提供预防保护和在感染早期的治疗功效，并且可能对卫生保健工作者和其他经常接触感染个体的人特别有用。

技术实现思路

[0008]在第一方面中，本公开提供了多肽，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101，其中所述多肽与SARS
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CoV
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2刺突糖蛋白受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)结合。在一个实施方案中，相对于参考多肽氨基酸序列的氨基酸取代选自表1中提供的示例性氨基酸取代。在另一个实施方案中，界面残基与参考多肽中的那些界面残基相同，或相对于参考多肽中的界面残基被保守取代。在另外的实施方案中，所述多肽包含两个或更多个拷贝的与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101。在一个实施方案中，所述多肽包含式Z1
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Z2
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Z3，其中：
[0009]Z1包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％
acute respiratory syndrome,SARS)冠状病毒感染(包括SARS
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Co
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V和SARS
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CoV
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2)的发展的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用一定量的本公开的多肽、核酸、表达载体、宿主细胞、寡聚物、组合物和/或药物组合物，以有效治疗或限制感染的发展。
附图说明
[0022]图1.用于方法1和方法2的SARS
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CoV
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2刺突受体结合结构域设计而设计的微型结合剂蛋白(Minibinder Protein)被编码在长寡核苷酸中，并被筛选以与酵母细胞表面上的经荧光标记的RBD的结合。深度测序鉴定了3个Ace2螺旋支架化设计(方法1)和150个从头界面设计(方法2)，所述设计是在进行RBD结合的FACS分选后明显富集的。设计在大肠杆菌(E.coli)中表达和纯化，并且许多被发现具有可溶性表达，在生物层干涉测量实验中结合RBD，并且可以有效地与ACE
‑
2竞争结合RBD(图2所示的示例)。基于BLI数据(例如参见图2)，微型结合剂的RBD结合亲和力是：LCB1<1nM，LCB3<1nM。LCB2、LCB4、LCB5、LCB6、LCB7、LCB8的亲和力范围为1～20nM，不同结合剂的相对强度为LCB4>LCB2>LCB9＝LCB5>LCB6>LCB7。
[0023]图2.从头设计的微型结合物与SARS
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CoV
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2刺突RBD的高亲和力结合。将生物素化的刺突RBD蛋白负载到链霉亲和素生物层干涉测量(biolayer interferometry,BLI)尖端(ForteBio Octet
TM
)上，并在洗涤后，将所述尖端浸入不同浓度的纯化Combo 1抗RBD微型结合剂中。在负载后，将尖端单独放入缓冲液中。(左侧和中间)响应曲线指示～Kd为300pM的亲和力。(右侧)如果将ACE
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2负载到RBD尖端，然后添加Combo 1，则微型结合剂会迅速使ACE
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2从BLI尖端上移开。
[0024]图3.针对SARS
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CoV
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2刺突RBD的从头设计的微型结合剂是热稳定的。在25℃、95℃以及在加热至95℃之后在25℃在圆二色性光谱仪中测量纯化的Combo 1微型结合剂。CD光谱的形状都非常相似，表明蛋白质在所有条件下都保持折叠。
[0025]图4.针对SARS
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CoV
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2刺突RBD的从头设计的微型结合剂在病毒中和测定中是有效的。SARS
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CoV
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2菌株2019n
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CoV/USA_WA1/2020获自疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control和Prevention)(Natalie Thornburg的礼物)。在Vero CCL81细胞(ATCC)中产生病毒原种，并通过对Vero E6细胞的病灶形成测定来进行滴定。将单克隆抗体(mAb)或微型结合剂的连续稀释液与102个病灶形成单位(focus
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种多肽，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101，其中所述多肽与SARS
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CoV
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2刺突糖蛋白受体结合结构域(RBD)结合。2.根据权利要求1所述的多肽，其中相对于参考多肽氨基酸序列的氨基酸取代选自表1中提供的示例性氨基酸取代。3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中界面残基与所述参考多肽中的那些界面残基相同，或相对于所述参考多肽中的界面残基被保守取代。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的多肽，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的多肽，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:136。6.根据权利要求5所述的多肽，其中所述多肽包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列在选自由2、4、5、14、15、17、18、27、28、32、37、38、39、41、42、49、52和55组成的组的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或全部18个残基处的氨基酸取代。7.根据权利要求6所述的多肽，其中所述取代选自表4中在给定行中单独地或组合列出的取代。8.根据权利要求1
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4中任一项所述的多肽，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:137至SEQ ID NO:163。9.根据权利要求8所述的多肽，其中所述多肽包含相对于SEQ ID NO:13的氨基酸序列在选自由2、6、8、9、13、14、19、22、25、26、28、29、34、35、37、40、43、45、49和62组成的组的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或全部20个残基处的氨基酸取代。10.根据权利要求6所述的多肽，其中所述取代选自表6中在给定行中单独地或组合列出的取代。11.根据权利要求1
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4中任一项所述的多肽，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:164。12.根据权利要求11所述的多肽，其中所述多肽包含相对于SEQ ID NO:101的氨基酸序
列在选自由63和75组成的组的一个或两个残基处的氨基酸取代。13.根据权利要求12所述的多肽，其中所述取代包括R63A和/或K75T。14.根据权利要求1
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13中任一项所述的多肽，所述多肽进一步包含在N末端和/或C末端处添加的一个或多个半胱氨酸残基。15.根据权利要求1
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14中任一项所述的多肽，所述多肽包含N
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连接的糖基化位点(即：NX(S/T)，其中X是任何氨基酸)。16.根据权利要求1
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15中任一项所述的多肽，所述多肽包含两个或更多个拷贝的所述氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101。17.根据权利要求16所述的多肽，其中所述两个或更多个拷贝的多肽都是相同的。18.根据权利要求16所述的多肽，其中所述两个或更多个拷贝的多肽是不完全相同的。19.根据权利要求16
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18中任一项所述的多肽，其中所述两个或更多个拷贝的多肽被氨基酸接头序列分开。20.根据权利要求9所述的多肽，其中氨基酸接头序列包含富含Gly
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Ser的(至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的Gly
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Ser残基)氨基酸接头。21.根据权利要求20所述的多肽，其中所述富含Gly
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Ser的接头包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：GG以及SEQ ID NO:35至SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:165至SEQ ID NO:171。22.根据权利要求19所述的多肽，其中所述氨基酸接头序列包含富含Pro(至少15％、20％、25％或更多的Pro残基)的氨基酸接头。23.根据权利要求22所述的多肽，其中所述富含Pro的氨基酸接头包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:97至SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:172至SEQ ID NO:176。24.根据权利要求19所述的多肽，其中所述氨基酸接头包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:177至SEQ ID NO:178。25.根据权利要求19
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24中任一项所述的多肽，其中所述氨基酸接头的长度独立地介于2
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100个氨基酸之间。26.根据权利要求16
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25中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含式Z1
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Z2
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Z3，其中：Z1包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:164；Z2包含任选的氨基酸接头；并且Z3包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:164；其中Z1和Z3可以是相同或不同的。
27.根据权利要求26所述的多肽，其中Z1和Z3是相同的。28.根据权利要求26所述的多肽，其中Z1和Z3是不同的。29.根据权利要求26
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28中任一项所述的多肽，其中：Z1包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:136；并且Z3包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:136。30.根据权利要求26
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28中任一项所述的多肽，其中：Z1包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:137至SEQ ID NO:163；并且Z3包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:137至SEQ ID NO:163。31.根据权利要求26
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28中任一项所述的多肽，其中：Z1包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:164；并且Z3包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:164。32.根据权利要求26
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28中任一项所述的多肽，其中：Z1和Z3中的一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:136；并且Z1和Z3中的另一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:137至SEQ ID NO:163。33.根据权利要求26
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28中任一项所述的多肽，其中：Z1和Z3中的一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:136；并且Z1和Z3中的另一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:164。34.根据权利要求26
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28中任一项所述的多肽，其中：Z1和Z3中的一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:137至SEQ ID NO:163；并且Z1和Z3中的另一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:164。35.根据权利要求26
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34任一项所述的多肽，其中所述多肽包含式B1
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B2
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Z1
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Z2
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Z3
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B3
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B4，其中：Z1、Z2和Z3如权利要求26
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34中任一项中所定义；B2和B3包含任选的氨基酸接头；并且B1和B4中的一者...

【专利技术属性】
技术研发人员：L，
申请(专利权)人：西北大学圣路易斯华盛顿大学，
类型：发明
国别省市：