多肽荧光探针及其在检测活细胞内聚集蛋白中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种多肽荧光探针及其在检测活细胞内聚集蛋白中的应用，该荧光探针的结构式由5部分组成：QB荧光小分子、穿膜肽(RRRRRR)、线粒体毒性肽(KLAKLAKKLAKLAK)、CB酶切位点(GFLG)以及叠氮肽。本发明专利技术制备的多肽荧光探针可以用于活细胞内聚集蛋白的检测，解决传统的荧光探针只能检测溶液的聚集蛋白现象，可以避免固定细胞的试验步骤。可以避免固定细胞的试验步骤。可以避免固定细胞的试验步骤。

【技术实现步骤摘要】
多肽荧光探针及其在检测活细胞内聚集蛋白中的应用


[0001]本专利技术涉及分子探针应用
，具体涉及一种多肽荧光探针及其在检测活细胞内聚集蛋白中的应用。

技术介绍

[0002]蛋白质的结构对其功能至关重要，蛋白质的异常聚集行为可能导致许多神经退行性疾病，比如阿尔茨海默病、渐冻人症、帕金森病、亨廷顿症等。
[0003]蛋白质的聚集过程十分复杂，包括解折叠、错误折叠、形成可溶性的聚集蛋白体、不溶性聚集蛋白体等。目前，商业化聚集蛋白靶向探针(如ThT和刚果红等amyloid探针)，通常只能在胞外识别β折叠高度富集晚期淀粉样变聚集态蛋白质。而商业化的细胞内PROTEOSTATR试剂盒，无法穿透细胞膜，只能在固定后的死细胞内探测聚集态的蛋白质。科学家们较少实现在活细胞内观察研究聚集态蛋白的检测分析。因此，若能在活细胞内检测蛋白质的聚集行为将有助于加深对疾病发病机理的理解。
[0004]由于缺乏活细胞内检测蛋白质聚集的有效方案，人们对活细胞内蛋白质聚集行为的发生、发展和机制认识不全面，因此开发一种能够在活细胞内检测聚集蛋白行为的多肽荧光探针具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0005]基于此，有必要提供多肽荧光探针及其在检测活细胞内聚集蛋白中的应用。
[0006]本专利技术采用如下技术方案：
[0007]本专利技术提供一种可用于活细胞内聚集蛋白检测的多肽荧光探针，其结构主要由QB有机荧光小分子、穿膜肽、线粒体毒性肽、CB酶切位点GFLG和叠氮肽反应连接而成，叠氮肽为线粒体复合体IV抑制部分。具体化学结构式如图1所示。
[0008]可用于活细胞内聚集蛋白检测的多肽荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0009]S1，分别制备含纯多肽RKN的水溶液和含QB有机荧光小分子的溶液，混合，加入催化剂，搅拌反应时长不低于12h，得多肽荧光探针粗产物。
[0010]S2，对所述多肽荧光探针粗产物纯化，即得多肽荧光探针。
[0011]在其中一些实施例中，多肽RKN和QB有机荧光小分子的反应摩尔比为1：5。
[0012]在其中一些实施例中，催化剂选自PyBOP、PPTS和NMM的混合。
[0013]在其中一些实施例中，采用高效液相色谱对所述粗产物进行纯化，工艺条件为：采用色谱柱为Welchrom C18色谱柱，采用流动相A和流动相B的流动相以1mL/min流速进行梯度洗脱，所述流动相A为含0.1％ TFA的水溶液，所述流动相B为含0.1％ TFA的乙腈溶液。
[0014]本专利技术还提供上述多肽荧光探针在活细胞内聚集蛋白检测中的应用。
[0015]具体地，上述多肽荧光探针可以应用于pH 6.5～7.4环境下的活细胞内线粒体成像。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0017](1)多肽荧光探针的结构式由5部分组成：QB有机荧光小分子，用于图像示踪和响应聚集蛋白；穿膜肽(RRRRRR)，有助于将探针进入细胞膜，线粒体毒性肽(KLAKLAKKLAKLAK)可以形成a螺旋破环线粒体膜，造成线粒体损伤；CB酶切位点(GFLG)将多肽切割成两部分发挥作用；叠氮肽为线粒体复合体IV抑制剂，进而抑制线粒体的氧化呼吸链，被酶切后的这两种多肽分别作用于线粒体造成线粒体损伤。采用该多肽荧光探针可以实现活细胞线粒体内聚集蛋白的检测，解决传统的荧光探针只能检测溶液的聚集蛋白，避免固定细胞的过程。
[0018](2)本专利技术用于活细胞线粒体内聚集蛋白的荧光探针的制备方法，工艺简单，成本低。
[0019](3)本专利技术提供的多肽荧光探针表现出明显的分子转子发光现象，避免背景荧光的干扰，实现活细胞内聚集蛋白检测，在生物医学成像领域中有着巨大的应用前景。
附图说明
[0020]图1为用于检测活细胞线粒体内聚集蛋白的多肽荧光探针的化学结构图。
[0021]图2为图1中多肽荧光探针的合成路线图。
[0022]图3为图1中多肽荧光探针的质谱表征图。
[0023]图4为图1中多肽荧光探针检测聚集蛋白溶液中荧光强度变化的实验图。
[0024]图5为图1中多肽荧光探针染色由MG132诱导的乳腺癌MCF
‑
7细胞的共聚焦显微照片图。
[0025]图6为图1中的多肽荧光探针染色由星孢菌素诱导的乳腺癌MCF
‑
7细胞的共聚焦显微照片图。
具体实施方式
[0026]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本专利技术。
[0027]在本专利技术实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本专利技术实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0028]实施例1
[0029]本实施例提供一种用于检测活细胞线粒体内聚集蛋白的多肽荧光探针，其化学结构如图1所示。
[0030]该多肽荧光探针的结构由以下5部分组成：
[0031]1)QB有机荧光小分子，用于图像示踪和响应聚集蛋白；
[0032]2)穿膜肽(RRRRRR)，有助于将探针进入细胞膜；
[0033]3)线粒体毒性肽(KLAKLAKKLAKLAK)，可以形成a螺旋破环线粒体膜，造成线粒体损伤；
[0034]4)CB酶切位点(GFLG)，将多肽切割成两部分发挥作用；
[0035]5)叠氮肽为线粒体复合体IV抑制剂，进而抑制线粒体的氧化呼吸链，被酶切后的这两种多肽分别作用于线粒体造成线粒体损伤。
[0036]该多肽荧光探针可以实现活细胞内聚集蛋白的检测，解决传统探针只能检测溶液
的聚集蛋白行为，可以避免固定细胞的过程。
[0037]本实施例进一步多肽荧光探针的制备方法，合成路线参见图2，包括如下步骤：
[0038]S1，将纯多肽RKN(委托吉尔生化公司合成)用水溶解制备多肽RKN水溶液。
[0039]将QB有机荧光小分子(按照论文Hashoul,D,Yavin,et al.Single point mutation detection in living cancer cells by far
‑
red emitting PNA
‑
FIT probes[J].Chemical communications,2016中的方法合成)用DMF溶解制备QB溶液。
[0040]混合多肽RKN水溶液和QB溶液，加入催化剂，进行酰胺反应，反应过程中伴随的搅拌时间不低于12h，得多肽荧光探针粗产物。
[0041]S2，将步骤S1制备的粗产物通过高效液相色谱纯化，得到多肽荧光探针。本部分采用的高效液相色谱柱为Welchrom C18色谱柱(5μm，250
×
4.6mm)，采用流动相A和流动相B的流动相以1mL/min流速进行梯度洗脱，流动相A为含0.1％ TFA的水溶液，流动相B为含0.1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多肽荧光探针，其结构式为：2.权利要求1所述多肽荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1，分别制备含多肽RKN的水溶液和含QB有机荧光小分子的溶液，混合含多肽RKN的水溶液和含QB有机荧光小分子的溶液，加入催化剂，搅拌反应时长不低于12h，得多肽荧光探针粗产物；S2，对所述多肽荧光探针粗产物纯化，即得多肽荧光探针。3.根据权利要求2所述多肽荧光探针的制备方法，其特征在于，多肽RKN和QB有机荧光小分子的反应摩尔比为(1～1.5)：(5～6)。4.根据权利要求2所述多肽荧光探针的制备方法，其特征在于，催化剂选自PyBOP、PPTS和NMM的混合。5.根据权利要求2至4任一项所述多肽荧光探针的制备方法，其特征在于，采用高效液相色谱对...

【专利技术属性】
技术研发人员：娄筱叮，夏帆，陈博超，胡晶晶，
申请(专利权)人：中国地质大学武汉，
类型：发明
国别省市：