一种多肽环肽及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种多肽环肽及其应用，该多肽环肽是由线性组胺素经特定条件下的叠氮

【技术实现步骤摘要】
一种多肽环肽及其应用
[0001]本申请主张中国在先申请，申请号:202110851741.0，申请日2021年7月27日的优先权；其所有的内容作为本专利技术的一部分。


[0002]本专利技术涉及生物医学技术及个人护理领域，具体而言，涉及一种多肽环肽及其应用。

技术介绍

[0003]很多在体外具有很好的生物活性和稳定性的直链肽，进入体内后活性很快消失。因为体内环境复杂，存在各种各样的酶。直链肽在酶的作用下容易被降解代谢，进而失去活性。为了得到生物活性好、半衰期长，受体选择性更高的多肽，文献报道过很多多肽修饰的方法，其中包括将直链肽改造成环肽。这种大环分子具有明确的固定构象，能够与受体更好地契合，且对氨肽酶和羧肽酶的敏感性大大降低。因此环肽的代谢稳定性和生物利用度远远高于直链肽。
[0004]环肽根据环合方式分为首尾相连环肽(Head
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to
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tail)、侧链和侧链相连环肽(Sidechain
‑
to
‑
sidechain)、侧链和端基相连环肽(Sidechain
‑
to
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end)、含二硫桥的环肽(Disulfid e
‑
bridge)、订书肽(Stapled Peptide)、以及含有其他桥连结构的环肽。从合成方法上讲，首尾相连的环肽的合成难度最大。因为直链肽的肽键具有很强的p键特征，分子更偏爱形成反式构象，呈舒展状态，造成属于反应中心的端基的羧基和氨基在空间上距离较远，不利于发生分子内缩合反应，而是有利于分子间缩合。
[0005]首尾相连的环肽通常是N端和C端游离的直链肽在稀溶液中(10
‑3～10
‑4M)由羧基和氨基形成酰氨键来合成。直链前体中的氨基酸种类和数目对成环的难易程度和环肽的收率起着至关重要的作用。
[0006]由于环肽的前体——直链肽所包含的氨基酸的数目和种类的千差万别，造成了环肽合成方法的多样化。对某种直链肽表现出高效、快速缩合作用的试剂和方法对另外一种肽链就可能变得低效或无效。因此，根据目标环肽的序列寻找对应的环肽合成方法必须通过长期认真的探索和艰辛的努力。
[0007]首尾环化是提高肽结构刚度和稳定性的一种重要方法。由于外切蛋白酶，如氨肽酶或羧肽酶，可以识别直链肽的N端或C端基团进而将其水解。因此，相比直链肽，环肽对酶的蛋白水解更有抵抗力。环状结构预先限制了环状肽的构象，封闭了两端暴露的氨基和羧基，使得酶切效果变差，从而降低了受体结合过程中的熵成本。这一特征增加了它们对受体和蛋白质靶点的结合亲和力和特异性。因此，它们适用于探测和调节蛋白
‑
蛋白的相互作用。通过适当的设计，环肽可以模拟作为受体识别关键模块的蛋白质二级结构(如α螺旋和β发夹)，它们是受体识别的关键模块。所有这些有利的药理特征都使环肽成为潜在的候选药物。
[0008]肽链的合成方法主要有液相合成和固相合成。液相合成使用完全保护的线性前体
(两个环化末端除外)，在偶联试剂存在下的直接偶联。然而，这种策略存在几个缺点，导致合成效率低。首先，环化必须在高稀释溶液中进行，以防止/减少分子间反应引起的低聚化，因为肽环化是一个熵减的过程，导致溶剂的大量浪费，以及操作与后处理过程的繁琐。其次，活化的C端羧酸容易发生差向异构化进而产生一对环异构体，而差向异构体也可能会在碱性条件下，通过α质子的去质子化，将激活的C端羧酸烯醇化而产生，因此液相合成对纯化过程要求非常高，导致合成产量降低。最后，在有机溶剂中，一些完全保护的线性肽前体的溶解度很差，会阻止其发生环化反应。因此固相多肽合成(SPPS)方法更有竞争力。
[0009]目前现有的首尾环化方法主要包括：树脂上的环化(on
‑
resin cyclization)、化学连接(chemical ligation)、叠氮
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烯烃环加成(azide
–
alkyne cycloaddition)、关环复分解(ring
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closing metathesis)和静电控制的大环化(electrostatically
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controlled macro
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cyclizations)等。
[0010]已有采用转肽酶Sortase A法制备环化Hst1的相关报道(Sortase A as a tool for high
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yield histatin cyclization，Jan G.M.Bolscher，The FASEB Journal.Research Communication)，合成高活性的Hst1环肽，但由于采用Sortase A酶法步骤繁琐，催化效率低(0.1
‑
1摩尔当量)，反应时间长(20小时以上)，制得的环肽溶解性差。此外，该方法需要大的识别单元，在首尾两端引入冗余的氨基酸序列，不必要地增加了原始多肽的长度和序列复杂度，原子经济性差，且有多聚物产生风险。而且其转肽酶反应的机理具有可逆性，有导致已生成的环肽裂解的风险。同时由于Sortase A酶价格高，而且属于细菌酶，容易含有细菌产物残留，从而带来免疫原、致病微生物等工艺安全问题。综上原因，Sortase A酶法难以制备规模化可工业生产的高纯度的Hst1环肽。此外，CN103249426A公开了一种采用二硫键法制备的富组蛋白环状类似物，但二硫键法制备的通常为与侧链相连的环肽，难以制得稳定的首尾连接环肽，且不适用于不含有半胱氨酸残基的多肽序列。
[0011]因此急需一种更简便、高效、副反应少、环化产物溶解性高、安全无菌、可规模化生产的多肽首尾环肽的制备方法，从而制得具有更高活性和更好的稳定性的组胺素首尾环肽。

技术实现思路

[0012]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种多肽环肽及应用，通过特定条件下的叠氮
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炔环加成反应制得带有三唑环的组胺素首尾环肽，其生物活性与线性组胺素相比提高了1000倍，能以线性组胺素千分之一的剂量，达到线性组胺素相同的效果，高于已有的组胺素环肽，且相对于二硫键环化肽拥有显著提升的稳定性和抗生物代谢降解作用，相对于Sortase A酶法环化肽明显改善了溶解性，构象独特，环化过程温和简便、效率高、并能制得高纯度的组胺素首尾环肽，可明显提升组胺素的生物活性和临床功效，具有非常好的产业化前景。
[0013]一方面，本专利技术提供了一种多肽环肽，其结构式如式1或式2所示：
[0014][0015]其中，Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4为任意一种氨基酸；peptide sequence为Hst1～Hst12中任一项的序列，或与Hst1～Hst12中任一项的序列具有80％以上同源性的序列及其片段，或Hst1～Hst12中任一项的序列及其的衍生修饰肽段，所述Hst1～Hst12分别具有如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多肽环肽，其特征在于，其结构式如式1或式2所示：其中，Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4为任意一种氨基酸；peptide sequence为Hst1～Hst12中任一项的序列，或与Hst1～Hst12中任一项的序列具有80％以上同源性的序列及其片段，或Hst1～Hst12中任一项序列及其片段的衍生修饰肽段，所述Hst1～Hst12分别具有如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的多肽环肽，其特征在于，所述衍生修饰包括烷基化、酰化、酯化、磷酸化、磺酸化、糖苷化、PEG化、生物素标记、荧光标记、同位素标记、D型、链接linker、载体蛋白偶联或特殊氨基酸中的一种或多种。3.如权利要求2所述的多肽环肽，其特征在于，其结构式如式3或式4所示：其中，n＝1～6，m＝0～3，x＝0或1，a＝1～6，b＝0～2，R基为任意一种氨基酸的R基。...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴刚，卢云宇，吴丽勇，程柳行行，雷肖璇，
申请(专利权)人：杭州彗搏科技有限公司，
类型：发明
国别省市：