基于SpyTag-SpyCatcher的AnnexinV偶联荧光蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于SpyTag

【技术实现步骤摘要】
基于SpyTag
‑
SpyCatcher的Annexin V偶联荧光蛋白的方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体为基于SpyTag
‑
SpyCatcher的Annexin V偶联荧光蛋白的方法。

技术介绍

[0002]源于CnaB2结构域的SpyTag/SpyCatcher体系，以其在多种条件下均能自发形成稳定异肽键的优势在蛋白质领域获得广泛应用，如生偶联、疫苗的合成和耐热酶的制备等。CnaB2是Streptcoccuspyogenes纤粘连蛋白FbaB中分离出来的一个结构域。CnaB2可被拆分为两个部分:SpyTag(13个氨基酸残基)和SpyCatcher(116个氨基酸残基)。SpyTag中的Asp和SpyCatcher上的Lys能自发反应生成异肽共价键，这就将蛋白质组装和化学反应结合在一起，是可基因编码的化学反应。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于SpyTag
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SpyCatcher的AnnexinV偶联荧光蛋白的方法，其特征在于，具体包括下列步骤：(1)表达载体SpyCatcher
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AnnexinV、SpyTag
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GFP、SpyTag
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YFP、SpyTag
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RFP的构建化学合成SpyCatcher
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AnnexinV、SpyTag
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GFP、SpyTag
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YFP、SpyTag
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RFP的基因序列，并通过同源重组的方法连接到表达载体pET28b上；(2)SpyCatcher
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AnnexinV、SpyTag
‑
GFP、SpyTag
‑
YFP、SpyTag
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RFP蛋白的诱导表达将表达载体转化RosettaB(DE3)感受态大肠杆菌，用卡那霉素和氯霉素双抗LB固体培养基37℃培养过夜筛选单菌落，即为原核表达工程菌，SpyCatcher
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AnnexinV、SpyTag
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GFP、SpyTag
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YFP、SpyTag
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RFP的原核表达工程菌分别如下：pET
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SpyCatcher
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AnnexinV
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Rosetta
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gamiB(DE3)，pET
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SpyTag
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GFP
‑
Rosetta
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gamiB(DE3)，pET
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SpyTag
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YFP
‑
Rosetta
‑
gamiB(DE3)，pET
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SpyTag
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RFP
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Rosetta
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gamiB(DE3)；挑取单菌落于20mL卡那霉素
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氯霉素双抗LB液体培养基中37℃，220转/分培养过夜，然后按照1：100的比例接种于1L含双抗的LB液体培养基中，37℃，220转/分培养3～4h至OD600到0.4～0.6，然后将菌液置于冰水混合物中骤冷，加入IPTG使其终浓度为0.5mM，取出50mL菌液作为诱导前的对照，16℃，120转/分培养14h后3500g离心10min收集菌体，弃上清，菌体用40mL的裂菌缓冲液重悬，60W超声破碎30min，超5s停5s，12000g离心10min收集上清；(3)SpyCatcher
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AnnexinV、SpyTag
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GFP、SpyTag
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YFP、SpyTag
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RFP蛋白的层析纯化将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍柱体积的层析溶液BufferW1洗涤，将样品加到NTA层析柱中，流速控制在0.2mL/min，收集穿透(FT)，用于分析蛋白质与树脂的结合情况，层析用5倍NTA柱体积的层析溶液BufferW1洗涤，流速控制在0.5mL/min，分别用5倍柱体积的层析溶液BufferW1、BufferW2、BufferW3、ElutionBuffer洗涤和洗脱，流速控制在0.2mL/min左右，收集洗脱液，每管收集一个柱体积，确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况，然后用SDS
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PAGE胶分析每管蛋白质大致含量；(4)SpyCatcher
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AnnexinV分别与SpyTag
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GFP，SpyTag
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YFP和SpyTag
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YFP蛋白的偶联偶联具体条件如下：Buffer：25mMTris
·
HCl，150mMNaCl，pH8.5；温度：25℃；时间：16h。2.根据权利要求1所述的基于SpyTag
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SpyCatcher的AnnexinV偶联荧光蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)所述裂菌缓冲液为500mMNaCl、20mMPB、10mM咪唑的混合液，所述裂菌缓冲液的pH为7.4。3.根据权利要求1所述的基于SpyTag
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SpyCatcher的AnnexinV偶联荧光蛋白的方法，其特征在于，步骤(3)中的层析溶液BufferW1的配方如下：50mMTris
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HC...

【专利技术属性】
技术研发人员：冷毅斌，兰萍，杜正伟，骆祚琴，王娟，
申请(专利权)人：武汉戴安生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：