抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的制备方法技术

本发明专利技术公开了抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的制备方法，包括如下步骤：(1)制作培养基、(2)培养幽门螺杆菌、(3)幽门螺杆菌的鉴定、(4)幽门螺杆菌的粗提、(5)幽门螺杆菌的纯化、(6)幽门螺杆菌活性峰的筛选和收集、(7)幽门螺杆菌酶活的测定、(8)幽门螺杆菌超声粉碎抗原的制备、(9)幽门螺杆菌分泌蛋白抗原的制备、(10)混合抗原的制备、(11)弗氏佐剂免疫试剂的制备、(12)鸡的免疫、(13)卵黄抗体的粗提—水稀释法、(14)卵黄抗体的纯化、(15)卵黄抗体浓度与纯度的鉴定、(16)卵黄抗体效价的测定、(17)鸡卵黄抗幽门螺杆菌抗体蛋黄粉的制备。本发明专利技术属于生物制药技术领域，具体是提供了一种对幽门螺旋杆有很好的抑制作用，对Hp感染具有较强的抑制作用的抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的制备方法。法。法。

【技术实现步骤摘要】
抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的制备方法


[0001]本专利技术属于生物制药
，具体是指抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的制备方法。

技术介绍

[0002]幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)主要定植于胃型上皮如胃粘膜、十二指肠粘膜的胃型上皮化生区、食管的胃型上皮化生区(Barrett食管)。在牙斑中分离出Hp提示其可在非胃型上皮环境中短暂存活或繁殖。Hp一旦感染人体，绝大多数长期在胃内定植，极少数可自然消退。
[0003]Hp感染可能演化为萎缩性胃炎、消化性溃疡、甚至胃癌和胃MALT淋巴瘤等更严重的疾病。所以对Hp相关疾病预防、治疗的研究近几年来已经成为Hp研究的重点和热点。
[0004]一直以来，Hp感染的治疗以含抗生素的三联或抗生素+PPI的四联疗法为主，但长期联合疗法极易使Hp产生耐药性，加上抗生素的不良反应导致患者对联合疗法的耐受性降低。因此，探寻更安全、有效的治疗方法对Hp根除治疗具有重要意义。
[0005]卵黄抗体是母鸡产蛋中含有的免疫球蛋白。在给予母鸡灭活的细菌或病毒免疫后，母鸡血液中可产生特异性IgY抗体，IgY抗体流经卵细胞中可逐渐蓄积，形成卵黄抗体。已有研究报道，伤寒沙门菌和大肠埃希菌免疫后产生的卵黄抗体可显著抑制这些细菌，导致小鼠肠道炎症反应。目前有关卵黄抗体抗Hp的研究报道较少，仅有少量的文献报道了卵黄抗体对Hp增殖的抑制作用。
[0006]卵黄抗体抗Hp感染的机制目前尚不清楚。有研究显示，卵黄抗体可通过与Hp细胞壁上相关蛋白结合，抑制细菌细胞壁的完整性，从而抑制细菌生长。此外，卵黄抗可能黏附在细菌菌毛上，从而使细菌不能黏附于黏膜细胞而脱落。

技术实现思路

[0007]为解决上述现有难题，提供了一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备方法，本申请通过多种抗原制备幽门螺旋杆菌卵黄抗体，卵黄抗体效价达1∶200000，对幽门螺旋杆有很好的抑制作用，可显著降低小鼠Hp感染率，对Hp感染具有较强的抑制作用。
[0008]本专利技术采取的技术方案如下：抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0009](1)制作培养基：每100ml水中加入3.9克哥伦比亚琼脂基础培养基，加热使其溶解，用氢氧化钠溶液调pH至7.2，然后121℃杀菌20min，待培养基冷却至适宜温度后，加入7ml新鲜无菌羊血，混匀，快速浇平板，得到哥伦比亚琼脂加血培养基。
[0010](2)培养幽门螺杆菌：将菌种采用接种环直接密集涂布的方式接种于步骤(1)得到的哥伦比亚琼脂加血培养基上，将接种后的平板放入真空干燥器中，同时放入一盛有50％甘油溶液的小烧杯，以保持菌体生长所需湿度。将真空干燥器抽气至真空度0.08MPa，关闭干燥器，接上装有混合气体的氧气瓶，充气，待气压升至大气压后重复上述步骤一次，恒温培养箱中37℃培养3天。
[0011](3)幽门螺杆菌的鉴定：
[0012]观察：取步骤(2)中培养3天后的平板，观察菌落形态，鉴别其是否为幽门螺杆菌菌落典型形态。
[0013]镜检：采用1000
×
普通光学显微镜进行镜检，观察单个幽门螺杆菌的形态。
[0014]革兰氏染色：革兰氏染色鉴定其是否为G
－
。
[0015]快速尿素酶试验：酶标板孔中加入尿素酶酶活测试缓冲液100μl，用接种环挑少量菌于测试缓冲液中，观察缓冲液颜色变化，颜色由红色变为紫色为阳性，不变为阴性。
[0016](4)幽门螺杆菌的粗提：采用超声破壁法粗提尿素酶。过程如下：30块平板
→
用接种环将菌膜刮入60ml的冰浴缓冲液(PB缓冲液，0.05mol/LpH7.2)中
→
冰浴超声破壁(超声条件：间隔时间1s，超声时间1s，全程时间15min)
→
冷冻离心(8000
×
g，20min4℃)
→
取上清，得到粗酶，测定蛋白浓度和酶活。
[0017](5)幽门螺杆菌的纯化：
[0018]离子交换色谱：采用DEAE
‑
SepharoseFF(1.6
×
30cm)离子交换色谱柱。上样前先对色谱柱进行预处理，先后用1mol/LNaCl、1mol/L的NaOH洗脱柱，上样前用样品缓冲液(PB缓冲液，0.05mol/L，pH7.2)平衡柱子，上样后检测流出液的吸光度，直到吸光度A
280
小于0.03时开始用含NaCl浓度梯度为0～1.5mol/L的PB样品缓冲液300ml梯度洗脱，流速为45ml/h。收集酶活洗脱峰。
[0019]凝胶过滤：采用凝胶Superdex200(1.2
×
100cm)进一步的纯化样品，得到高度纯化样品。上样前，用大约两倍柱体积的样品缓冲液平衡色谱层析柱。将离子交换所得样品用样品缓冲液透析充分，浓缩后上样，洗脱时间大约为1倍柱体积时间，流速为15ml/h。收集酶活洗脱峰。
[0020](6)幽门螺杆菌活性峰的筛选和收集：在96孔酶标板中，每孔加入100μl尿素酶酶活测试缓冲液，再从收集管中每管取50μl洗脱液加入到酶标孔中，加入速度要快使得延迟时间最小，加完后立即用保鲜膜盖住酶标板，37℃温育，560nm测定吸光度，测定时间点分别为0min、5min和15min。同时测定收集管中的吸光度A
280
值，结合两者的结果收集洗脱峰。透析后浓缩，4℃或冷冻保存。
[0021](7)幽门螺杆菌酶活的测定：
[0022]标准曲线的测定：25％浓氨水稀释100倍，准备16个25ml容量瓶，分别加入24ml、21ml、18ml、15ml、12ml、9ml、6ml、3ml氨水稀释液，定容，每个体积做两个平行样。45℃保温后的1.2ml尿素酶酶活测试缓冲液加入到2ml比色皿中，将560nm处吸光度调到0，不移动比色皿的情况下分别加入40μl上述各稀释度的氨水，用200μl移液枪来回打几下使得测试缓冲液和氨水立即混合，当吸光度不再变化时读数。以吸光度A为横坐标，氨水浓度为纵坐标作图，由曲线初始的线性部分斜率可估算出氨浓度和吸光度之间的关系。由于25％浓氨水试剂容易挥发，故氨水稀释液的准确浓度需要用奈氏定氨法测定。
[0023]酶活的测定：先将测试缓冲液45℃保温，1.2ml快速加入到2ml比色皿中，将560nm处吸光度调到0，不移动比色皿的情况下加入40μl酶液，立即用移液枪来回混合，最大延迟时间不超过15s，每15s读一次数，直到吸光度变化值
△
A≤0.03则停止读数。以吸光度A对时间作图，
△
A/t值由图初始的线性部分得出。反应所产生的氨的摩尔浓度由
△
A和上述系列稀释的氨水溶液所测定的标准曲线得出，测定酶的蛋白浓度后可得出酶的比酶活。
[0024]蛋白浓度和纯度鉴定：测定蛋白质浓度采用Bradford法，蛋白质纯度的鉴定采用SDS
‑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)制作培养基：每100ml水中加入3.9克哥伦比亚琼脂基础培养基，加热使其溶解，用氢氧化钠溶液调pH至7.2，然后121℃杀菌20min，待培养基冷却至适宜温度后，加入7ml新鲜无菌羊血，混匀，快速浇平板，得到哥伦比亚琼脂加血培养基。(2)培养幽门螺杆菌：将菌种采用接种环直接密集涂布的方式接种于步骤(1)得到的哥伦比亚琼脂加血培养基上，将接种后的平板放入真空干燥器中，同时放入一盛有50％甘油溶液的小烧杯，以保持菌体生长所需湿度。将真空干燥器抽气至真空度0.08MPa，关闭干燥器，接上装有混合气体的氧气瓶，充气，待气压升至大气压后重复上述步骤一次，恒温培养箱中37℃培养3天。(3)幽门螺杆菌的鉴定：观察：取步骤(2)中培养3天后的平板，观察菌落形态，鉴别其是否为幽门螺杆菌菌落典型形态。镜检：采用1000
×
普通光学显微镜进行镜检，观察单个幽门螺杆菌的形态。革兰氏染色：革兰氏染色鉴定其是否为G
－
。快速尿素酶试验：酶标板孔中加入尿素酶酶活测试缓冲液100μl，用接种环挑少量菌于测试缓冲液中，观察缓冲液颜色变化，颜色由红色变为紫色为阳性，不变为阴性。(4)幽门螺杆菌的粗提：采用超声破壁法粗提尿素酶。过程如下：30块平板
→
用接种环将菌膜刮入60ml的冰浴缓冲液(PB缓冲液，0.05mol/LpH7.2)中
→
冰浴超声破壁(超声条件：间隔时间1s，超声时间1s，全程时间15min)
→
冷冻离心(8000
×
g，20min4℃)
→
取上清，得到粗酶，测定蛋白浓度和酶活。(5)幽门螺杆菌的纯化：离子交换色谱：采用DEAE
‑
SepharoseFF(1.6
×
30cm)离子交换色谱柱。上样前先对色谱柱进行预处理，先后用1mol/LNaCl、1mol/L的NaOH洗脱柱，上样前用样品缓冲液(PB缓冲液，0.05mol/L，pH7.2)平衡柱子，上样后检测流出液的吸光度，直到吸光度A
280
小于0.03时开始用含NaCl浓度梯度为0～1.5mol/L的PB样品缓冲液300ml梯度洗脱，流速为45ml/h。收集酶活洗脱峰。凝胶过滤：采用凝胶Superdex200(1.2
×
100cm)进一步的纯化样品，得到高度纯化样品。上样前，用大约两倍柱体积的样品缓冲液平衡色谱层析柱。将离子交换所得样品用样品缓冲液透析充分，浓缩后上样，洗脱时间大约为1倍柱体积时间，流速为15ml/h。收集酶活洗脱峰。(6)幽门螺杆菌活性峰的筛选和收集：在96孔酶标板中，每孔加入100μl尿素酶酶活测试缓冲液，再从收集管中每管取50μl洗脱液加入到酶标孔中，加入速度要快使得延迟时间最小，加完后立即用保鲜膜盖住酶标板，37℃温育，560nm测定吸光度，测定时间点分别为0min、5min和15min。同时测定收集管中的吸光度A
280
值，结合两者的结果收集洗脱峰。透析后浓缩，4℃或冷冻保存。(7)幽门螺杆菌酶活的测定：标准曲线的测定：25％浓氨水稀释100倍，准备16个25ml容量瓶，分别加入24ml、21ml、18ml、15ml、12ml、9ml、6ml、3ml氨水稀释液，定容，每个体积做两个平行样。45℃保温后的1.2ml尿素酶酶活测试缓冲液加入到2ml比色皿中，将560nm处吸光度调到0，不移动比色皿
的情况下分别加入40μl上述各稀释度的氨水，用200μl移液枪来回打几下使得测试缓冲液和氨水立即混合，当吸光度不再变化时读数。以吸光度A为横坐标，氨水浓度为纵坐标作图，由曲线初始的线性部分斜率可估算出氨浓度和吸光度之间的关系。由于25％浓氨水试剂容易挥发，故氨水稀释液的准确浓度需要用奈氏定氨法测定。酶活的测定：先将测试缓冲液45℃保温，1.2ml快速加入到2ml比色皿中，将560nm处吸光度调到0，不移动比色皿的情况下加入40μl酶液，立即用移液枪来回混合，最大延迟时间不超过15s，每15s读一次数，直到吸光度变化值
△
A≤0.03则停止读数。以吸光度A对时间作图，
△
A/t值由图初始的线性部分得出。反应所产生的氨的摩尔浓度由
△
A和上述系列稀释的氨水溶液所测定的标准曲线得出，测定酶的蛋白浓度后可得出酶的比酶活。蛋白浓度和纯度鉴定：测定蛋白质浓度采用Bradford法，蛋白质纯度的鉴定采用SDS
‑
PAGE电泳。分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为4％，采用R250染色。(8)幽门螺杆菌超声粉碎抗原的制备：30块平板
→
用接种环将菌膜刮入60ml的冰浴缓冲液(PB缓冲液，0.05mo...

【专利技术属性】
技术研发人员：冷毅斌，兰萍，胡治勇，易秋分，
申请(专利权)人：武汉戴安生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：