一种高温制备L-丙氨酸的方法技术

本发明专利技术涉及酶催化技术领域，尤其是一种高温制备L

【技术实现步骤摘要】
一种高温制备L
‑
丙氨酸的方法


[0001]本专利技术涉及酶催化
，具体领域为一种高温制备L
‑
丙氨酸的方法。

技术介绍

[0002]L
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丙氨酸，即L
‑
α
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氨基丙酸，是人体中一种小的非必需氨基酸，丙氨酸是蛋白质构建中最广泛使用的氨基酸之一，参与色氨酸和维生素吡哆醇的代谢。它参与糖和酸代谢，可提高免疫力，并为肌肉组织、大脑和中枢神经系统提供能量，增强免疫系统，并在动物中显示出降低胆固醇的作用。L
‑
丙氨酸是一种具有重要价值的氨基酸，已应用于众多领域，如食品、制药和化学工业。L
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丙氨酸可作为合成氨基酸表面活性剂螯合剂MGDA的原料，同时也是合成维生素B6、甜味剂阿力甜和氨基丙醇(用于生产盐酸左氧氟沙星)的重要中间体。
[0003]在化学合成中，丙酸氯化法是合成L
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丙氨酸的常用方法。但该方法存在产品质量差、合成路线长、收率低、成本高、环境污染严重等缺点，目前已基本被淘汰。几十年来，L
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丙氨酸的商业生产一直由使用底物L
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天冬氨酸的天冬氨酸β
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脱羧酶(ASD)进行。Chibata以40％的L
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天冬氨酸为催化底物催化生成L
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丙氨酸，72h内L
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丙氨酸收率超过90％(I.Chibata,T.Kakimoto and J.Kato,Appl.Microbiol.,1965,13,638
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645)。Fusee用聚氨酯预聚物固定P.dacunhae的全细胞，通过每天提供23％的L
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天冬氨酸与0.1mMα酮戊二酸和0.1mM 5
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磷酸吡哆醛(PLP)，在31天内连续将L
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天冬氨酸转化为L
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丙氨酸。ASD由于其对L
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天冬氨酸的高活性，在工业上被成熟地应用于生产L
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丙氨酸(M.C.Fusee and J.E.Weber,Appl.Environ.Microbiol.,1984,48,694
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698)。
[0004]随着基因编辑和代谢工程的发展，L
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丙氨酸的生产正在向经济的发酵方法转变。Zhou等将野生型大肠杆菌敲除丙氨酸消旋酶，并敲入L
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丙氨酸脱氢酶基因，最终在摇瓶水平产量可达67.2g/L(Li Zhou,Can Deng,Wen
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Jing Cui,Zhong
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Mei Liu,Zhe
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Min Zhou.Efficient L
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alanine production by a thermo
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regulated switch in Escherichia coli.Applied Biochemistry and Biotechnology,2016,178:324
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337)。Zhang利用一种工程化的大肠杆菌W(大肠杆菌W)使用葡萄糖作为碳源在48小时内产生113.8g/L L
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丙氨酸(X.Zhang,K.Jantama,J.C.Moore,K.T.Shanmugam and L.O.Ingram,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2007,77,355
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366)。Jojima等利用谷氨酸棒状杆菌工程菌在厌氧下32小时产生98g/L L
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丙氨酸(T.Jojima,M.Fujii,E.Mori,M.Inui and H.Yukawa,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2010,87,159
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165)。Zhou等通过温度调节工程大肠杆菌，减轻了L
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丙氨酸对细胞生长的抑制，在40小时内获得120.8g/L L
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丙氨酸(L.Zhou,C.Deng,W.Cui,Z.Liu and Z.Zhou,Appl.Biochem.Biotechnol.,2016,178,324
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337)。
[0005]但与酶催化相比，发酵法生产L
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丙氨酸具有光学纯度差、副产物多、纯化困难等明显缺点。特别是在厌氧条件下，许多细胞内溶物及副产物在长期培养后由于细胞溶解而释放出来。氨基丙醇因涉及加氢反应对杂质要求高，发酵法指标远达不到合格要求，而进一步纯化的成本甚至超过L丙氨酸的生产成本，使得发酵路线应用面较窄，仅能满足部分化工需求，如MGDA合成。随着对L
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丙氨酸作为药物前体的需求不断增加，生产具有高光学纯度的L
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丙氨酸变得越来越必要。
[0006]天冬氨酸β
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脱羧酶(EC 4.1.1.12)是一种催化下列化学反应的酶，L
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天冬氨酸＝L
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丙氨酸+CO2。因此，这种酶有一个底物——L
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天冬氨酸，和两个产物——L
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丙氨酸和CO2。该反应是L
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丙氨酸工业合成的基础。这种酶属于裂解酶家族，特别是羧基裂解酶，其裂解碳
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碳键。该酶类的系统名称是L
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天冬氨酸4
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羧基裂解酶(L
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丙氨酸形成)。常用的其他名称包括脱硫酶、氨基丙二酸脱羧酶、天冬氨酸β
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脱羧酶、天冬氨酸ω
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脱羧酶、天冬氨酸ω
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脱羧酶、天冬氨酸β
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脱羧酶、L
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天冬氨酸β
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脱羧酶、半胱氨酸亚磺酸脱硫酶、L
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半胱氨酸亚磺酸脱硫酶和L
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天冬氨酸4
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羧基裂解酶。该酶参与丙氨酸和天冬氨酸代谢和半胱氨酸代谢。它使用一种辅助因子——磷酸吡哆醛(PLP)。编码L
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天冬氨酸
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β
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脱羧酶的基因Asd被发现广泛存在于假分枝杆菌、假单胞菌、粪产碱菌、醋酸杆菌、产气荚膜菌等微生物中。
[0007]CN1155716C通过诱变获得一株具有L
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天冬氨酸
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β
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脱羧酶活性的假单胞菌，对底物L
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天冬氨酸催化转化率接近100％，但需要5天进行催化反应，时间过长。
[0008]CN109536429A异源表达了不动杆菌(Acinetobacter sp.ACNIH2)来源的L
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天冬氨酸β
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脱羧酶，全细胞催化法生产L
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丙氨酸，37℃、200r/min下进行全细胞反应(振荡反本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高温制备L
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丙氨酸的方法，其特征在于：在天冬氨酸β
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脱羧酶突变体的存在下，45℃
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60℃下催化L
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天冬氨酸生成L
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丙氨酸。2.根据权利要求1所述的高温制备L
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丙氨酸的方法，其特征在于：所述天冬氨酸β

【专利技术属性】
技术研发人员：丁雪峰，王乾，李佳松，
申请(专利权)人：南京朗恩生物科技有限公司，
类型：发明
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