【技术实现步骤摘要】
一种盖塔病毒抗体胶体金免疫层析试纸条及其制备方法
[0001]本专利技术涉及一种盖塔病毒抗体胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，属于免疫
技术介绍
[0002]盖塔病毒(Getah virus，GETV)在病毒学分类上属于披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Alphavirus)，它是一种虫媒病毒，能够通过无脊椎动物如蚊子感染人类和脊椎动物如马、猪等中介进行传播。1955年Scherer等从盛产橡胶的马来西亚橡胶林中捕捉到的白雪库蚊(Culex gelidus)体内分离到该病毒，此后，在日本(1959年)及澳大利亚(1963年)也陆续分离到此病毒。到目前为止，全世界已分离到约30多种基因型共约50株盖塔病毒。而我国在1964年首次从海南分离得到了第一株盖塔病毒M1株。
[0003]首次报道赛马的发病与盖塔病毒有直接关系的文献是在1980年。赛马主要呈现高烧不退，直肠温度可持续达38.5℃
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40℃，患病马出现全身红斑，后腿行动异常，红肿；GETV同时也被认为是引起母猪繁殖障碍的病原...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种盖塔病毒抗体胶体金免疫层析试纸条，其是参考GETV SH05
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6株的结构蛋白E2序列，选取主要的抗原结构域按照大肠杆菌的密码子优化并合成基因序列，克隆至原核表达载体pColdⅠ并转化BL21，成功构建表达E2抗原的工程菌BL21，IPTG低温诱导表达，经纯化、复性、透析制备重组E2抗原，包被硝酸纤维素膜，进行胶体金点样和配比优化，得到盖塔病毒抗体胶体金免疫层析试纸条。2.一种权利要求1所述盖塔病毒抗体胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，其具体包括如下步骤：(1)将带有合成基因的pUC57
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E2质粒和表达载体pColdⅠ(+)
空载体进行Hind III和XbaⅠ双酶切反应，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，胶回收试剂盒回收与预期相符目的片段；得到粘性末端的E2基因和pColdⅠ载体；其中pUC57
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E2质粒酶切反应体系的组成为pUC57
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E2，45μl；XbaⅠ，2μl；Hind III，2μl；10
×
M Buffer，10μl；ddH2O，41μl；pColdⅠ(+)
酶切反应体系:pColdⅠ(+)，
35μl；XbaⅠ，1μl；Hind III 1μl；10
×
M Buffer 8μl；ddH2O，35μl；(2)表达载体pColdⅠ和目的基因E2的连接、转化：将带有粘性末端的目的基因GETV
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E2和表达载体pColdⅠ用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，将连接产物转化感受态细胞BL21，其中连接反应体系的组成为：GETV
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E2，4μl；pColdⅠ，1μl；5
×
Ligation Buffer，2μl；T4 DNA Ligase，2μl；ddH2O，1μl；转化后产物培养后的菌液涂于含有氨苄霉素的LB琼脂平板，37℃倒置培养过夜；(3)阳性克隆质粒的酶切鉴定：挑取单菌落置于含1％氨苄青霉素的LB肉汤培养基中震荡培养，使用小量质粒提取试剂盒进行质粒提取，使用HindIII和XbaⅠ限制性内切酶对重组质粒进行双酶切鉴定，同时使用Hind III单酶切克隆菌做阴性对照，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将酶切结果为阳性的菌液进行测序，阳性质粒命名为pCold
Ⅰ–
E2。(4)使用IPTG诱导E2蛋白的表达、纯化及复性：取测序正确的阳性菌液接种含有氨苄霉素LB肉汤培养基中震荡培养过夜，震荡过夜，以1:50的体积比转接于含1％氨苄青霉素的新鲜LB肉汤培养基中，继续培养至OD＝0.4
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0.6，加入IPTG于18℃低温诱导过夜，同步设立不加IPTG诱导的菌液及加IPTG的空载体转化的菌液作为对照，菌液进行SDS
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PAGE检测表达产物；表达产物以包涵体的方式存在，将鉴定正确菌体超声破碎后进行抗原的纯化和复性，即可得到重组Cold
Ⅰ–
E2抗原；(5)抗体胶体金免疫层析试纸条的制备：使用柠檬酸三钠与氯金酸制备胶体金溶液，向其中加入葡萄球菌A蛋白和BSA溶液制备得到胶体金
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金标记SPA复合物；将金标垫玻璃纤维8964使用胶体金封闭液封闭后烘干，将其浸润于OD530＝2.5
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3.0的金标抗体复合物溶液后烘干；将重组E2抗原和羊抗兔IgG作为包被于硝酸纤维素膜上作为检测带和质控带，装盒，即得抗体胶体金免疫层析试纸条。3.根据权利要求2所述盖塔病毒抗体胶体金免疫层析试纸条的制备方...
【专利技术属性】
技术研发人员：钟登科，郑江平，滑志民，王金福，战晓燕，尚月丽，魏建芳，向亮，向必吉，
申请(专利权)人：上海诺龙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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