一种实时荧光定量检测探针制造技术

本发明专利技术提供一种实时荧光定量检测探针，所述实时荧光定量检测探针包括3

【技术实现步骤摘要】
一种实时荧光定量检测探针


[0001]本专利技术属于生物
，具体地，涉及一种实时荧光定量检测探针。

技术介绍

[0002]核酸定量检测在分子检测领域中有非常广泛的需求，而基于扩增技术的荧光实时定量检测，由于其灵敏度高、动态范围大和设计的便利性，已经成为目前主流的核酸实时定量检测技术。该技术体系通常由扩增引物，扩增酶及其缓冲液体系和带有荧光
‑
淬灭基团对的寡核苷酸探针组成。荧光基团主要负责荧光报告，而配对的淬灭基团基于荧光共振能量转移原理在荧光基团一定的距离内，会吸收荧光基团的激发光而触发淬灭效果，根据此原理可以在核酸单/双链上进行荧光
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淬灭基团的结构偶联标记，通过荧光量的改变来报告寡核苷酸探针是否有一、二结构上的改变。目前流行的荧光
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淬灭寡核苷酸探针，应用在实时荧光定量PCR的主要类型有Taqman探针、双杂交探针、分子信标、蝎型探针、KASP技术等；在目前流行的RAA等温扩增中，适用的荧光
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淬灭探针则是依赖Nfo或exo酶的Nfo或exo探针。
[0003]以上提及的几种探针技术，Taqman依赖于Taq DNA聚合酶的5
’
外切作用；双杂交探针需要合成两个较长的探针，合成成本相对较高，对设计和扩增条件要求高，目前应用的非常少，技术持有者Roche公司基本没有在推广；分子信标、蝎型探针和KASP依赖于竞争性杂交，对扩增效率影响较大，对整体设计要求比较高，因此对比Taqman探针信噪比相对低，精密度相对差，较少应用于需要高灵敏度检测的实时定量应用中，而更多应用于基因分型这种不需要大动态范围定量的场景；而在重组酶介导等温扩增(Recombinase Aided Amplification，以下称RAA)这种恒温扩增场景，则以上几种探针都不适用，一则RAA中没有外切酶的活性，无法实现最有效的类Taqman技术；二则分子信标和蝎型探针类似的技术在RAA中还没得实用性的验证仅存在少量的学术报道，仅在NASBA技术中有相关的应用；而RAA专利持有者Twistamp自身使用的Nfo或exo技术，在原有的引物设计不稳定的基础上，进一步引入了聚合酶无法利用的类核酸的结构，对扩增效率有一定的影响，使反应复杂化，只能有限地用于终点法报告。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种实时荧光定量检测探针。
[0005]具体来说，本专利技术涉及如下方面：
[0006]1.一种实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述实时荧光定量检测探针包括3
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引物区和与所述3
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引物区连接的5
’
发夹区，所述5
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发夹区由反向互补的核苷酸链形成或所述5
’
发夹区由反向互补的核苷酸链与位于所述反向互补的核苷酸链之间的核苷酸链形成，在所述5
’
发夹区的核苷酸链上连接有荧光基团和与其配对的淬灭基团，其中所述荧光基团和所述淬灭基团间隔给定距离。
[0007]2.根据项1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述5
’
发夹区在聚合酶反应缓冲液中的融解温度大于等于65℃。
[0008]3.根据项1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述3
’
引物区的长度为10
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50个，优选16
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35个核苷酸(nt)。
[0009]4.根据项1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，形成5
’
发夹区的反向互补的核苷酸链的其中一条链的长度为5
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30nt，优选为8
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15nt。
[0010]5.根据项1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述位于所述反向互补的核苷酸链之间的核苷酸链的长度为1
‑
10nt，优选为1
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4nt。
[0011]6.根据项1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述荧光基团和淬灭基团分别位于所述反向互补的核苷酸链上，所述荧光基团和淬灭基团在反向互补的核苷酸链上相对的碱基距离小于等于10nt，优选为小于5nt。
[0012]7.根据项1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述荧光基团选自罗丹明类(RBITC/TAMRA)、荧光素及衍生物(FITC/FAM/TET)、菁染料类(Cy3/Cy5)、BODIPY类、Alexa Fluor系列、SYTO系列、TYE系列、ATTO系列、HEX、FAM
TM
、JOE
TM
、NED
TM
、ROX
TM
、TAMRA
TM
、TET
TM
和dyes中的一种，所述淬灭基团选自BHQ、MGB、Dabcyl、TAMRA、Eclipse、IBFQ和ZEN中的一种。
[0013]8.根据项1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述3
’
引物区的序列如SEQ ID NO:1所示，反向互补的核苷酸链的其中一条链的序列如SEQ ID NO:2和所示。
[0014]9.根据项1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述3
’
引物区的序列如SEQ ID NO:1所示，反向互补的核苷酸链的其中一条链的序列如SEQ ID NO:4所示。
[0015]10.项1
‑
9中任一项所述的实时荧光定量检测探针在PCR、重组酶聚合酶扩增中的应用。
[0016]11.一种核酸检测的方法，其包括：使用项1
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9中任一项所述的实时荧光定量检测探针。
[0017]本专利技术的实时荧光定量检测探针结构适用于不带5
’
端外切活性的引物对指数型扩增体系，包括PCR、RAA、LAMP等含有一对、两对或者三对引物的扩增体系，无需中间再另外设计探针，使常规检测的设计更简洁。
附图说明
[0018]图1为本专利技术的实时荧光定量检测探针的结构示意图；
[0019]图2为本专利技术的探针在TE缓冲液中的荧光强度随温度的变化曲线；
[0020]图3为本专利技术的探针在TE缓冲液、含有Taq的qPCR mix、含有KOD的PCR mix中的荧光强度随温度的变化曲线；
[0021]图4为本专利技术的探针在KOD PCR体系中的荧光强度随时间的变化曲线；
[0022]图5为本专利技术的探针在实时定量PCR体系中的荧光强度随时间的变化曲线；
[0023]图6为实施例5中模板浓度对数值对ct值的曲线；
[0024]图7为本专利技术的探针在RAA体系中的退火曲线；
[0025]图8为本专利技术的探针在退火处理后在RAA体系中的退火曲线；
[0026]图9为本专利技术的探针+假病毒模板在RAA体系中的荧光强度随时间的变化曲线；
[0027]图10为本专利技术的探针用于Ca本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述实时荧光定量检测探针包括3
’
引物区和与所述3
’
引物区连接的5
’
发夹区，所述5
’
发夹区由反向互补的核苷酸链形成或所述5
’
发夹区由反向互补的核苷酸链与位于所述反向互补的核苷酸链之间的核苷酸链形成，在所述5
’
发夹区的核苷酸链上连接有荧光基团和与其配对的淬灭基团，其中所述荧光基团和所述淬灭基团间隔给定距离。2.根据权利要求1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述5
’
发夹区在聚合酶反应缓冲液中的融解温度大于等于65℃。3.根据权利要求1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述3
’
引物区的长度为10
‑
50个，优选16
‑
35个核苷酸(nt)。4.根据权利要求1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，形成5
’
发夹区的反向互补的核苷酸链的其中一条链的长度为5
‑
30nt，优选为8
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15nt。5.根据权利要求1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述位于所述反向互补的核苷酸链之间的核苷酸链的长度为1
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10nt，优选为1
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4nt。6.根据权利要求1所述的实时荧光定量检测探针，其特征在于，所述荧光基团和淬灭基团分别位于所述反向互补...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘伟业，孙颖瑜，彭琼芳，孙阳，
申请(专利权)人：北京迅识生物科技有限公司浙江迅识生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：