同时检测食品中三种致病菌的多重荧光定量PCR引物组、试剂盒和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种同时检测食品中三种致病菌的多重荧光定量PCR引物组、试剂盒和应用，属于食源性致病菌分子检测技术领域。该引物组包括如下序列：扩增产志贺毒素大肠埃希氏菌基因wzx的如SEQ ID NO：1

【技术实现步骤摘要】
同时检测食品中三种致病菌的多重荧光定量PCR引物组、试剂盒和应用


[0001]本专利技术涉及食源性致病菌分子检测
，特别是涉及一种同时检测食品中三种致病菌的多重荧光定量PCR引物组、试剂盒和应用。

技术介绍

[0002]随着经济发展和人民生活水平的大幅提高，家庭的膳食结构得到普遍改善，对各类加工食品的消费量呈明显上升趋势。根据《中国奶业质量报告2017》中数据显示：2011
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2016年，全国乳制品消费量为从2480.5万吨增至3204.7万吨，年平均增长87.1万吨。伴随而来的，由食品引起的食源性致病菌危害性事件也在逐年增加，食品安全已经引起了人们和社会的普遍关注。
[0003]产志贺毒素大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌及沙门氏菌是食品中常见的食源性致病菌。产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin
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producing Escherichia coli)是一类可产生志贺毒素的大肠埃希氏菌,可引起包括出血性腹泻、溶血性尿毒征、肾衰竭在内的严重疾病甚至死亡,曾在世界范围内引起多起食物中毒事件。单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，是一种重要的食源性致病菌，在自然界分布广。蔬菜、乳制品、海产品、肉类和禽类等食品都已被证实是单核细胞增生李斯特氏菌的传播载体。该菌的易感人群主要是孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷者感染人体后可引起李斯特氏菌病，其症状表现为脑膜炎、败血症和流产等，致死率高达20％～50％。因此，单核细胞增生李斯特氏菌是世界卫生组织(WHO)食品安全工作计划中重点检测的四大食源性致病菌之一。沙门氏菌(Salmonella)是肠杆菌科中重要的常见人畜共患病原菌。该菌以肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌最为常见。在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第二位。其中细菌性食物中毒中70％～80％是由沙门氏菌引起的。
[0004]目前，针对上述食源性致病菌，目前的检测方法主要是以国家标准和行业标准为依据，该类标准主要是传统的培养以及生化鉴定方法，需要经过富集培养、选择性分离、形态特征观察、生化反应和血清学鉴定等过程，步骤繁琐，耗时长，特异性差、灵敏度低等缺点，且无法对人工难以培养的致病菌进行检测，难以满足现代规模化生产对检测速度的要求，不能较好的起到有效的监控和预防作用。因此，开发快速检测食源性致病菌的技术已近迫在眉睫。
[0005]近年来，随着科技的进步，免疫法和分子生物学检测技术被普遍应用到食源性致病菌的检测领域。免疫法主要包括酶联免疫吸附技术(ELISA)、酶联荧光技术、免疫胶体金技术和免疫磁珠技术等。分子检测技术主要包括常规PCR、多重PCR技术，环介导恒温扩增技术(LAMP)以及荧光定量PCR。但这些技术多少都存在一定的缺点，对食源性致病菌的快速准确检测造成了一定的影响。例如，酶联免疫吸附技术虽然特异性强，反应灵敏度高，操作简单，但由于制备单克隆抗体的高成本，使用ELISA测试各种食物样品的成本相对较高；普通PCR能够做到对致病菌的快速检测，但灵敏度低且不能对致病菌进行定量；多重PCR可以在
同一个体系中检测多个目标菌，但多组引物之间的组合易相互干扰，对引物的要求也比较高；染料法荧光定量PCR虽然可对致病菌进行定量检测，但由于引物和探针设计限制，使得一次实验只能检测一种致病菌，且特异性不高。因此，开发出一种能及时、快速且准确地检测与鉴定食品中致病菌的技术对于预防由食源性致病菌引起的食品公共安全事件具有重要意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种同时检测食品中三种致病菌的多重荧光定量PCR引物组、试剂盒和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术基于TaqMan探针法荧光定量PCR技术，针对食品中致病菌的特异性的致病基因，设计引物和荧光探针，通过优化反应体系和PCR扩增条件，开发出了能同时检测3种致病菌的高通量多重实时荧光定量PCR方法。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0008]本专利技术提供一种同时检测食品中三种致病菌的多重荧光定量PCR引物组，包括如下序列：
[0009]扩增产志贺毒素大肠埃希氏菌基因wzx的引物和探针，所述引物序列如SEQ ID NO：1
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2所示，所述探针序列如SEQ ID NO：3所示；
[0010]扩增单核细胞增生李斯特氏菌基因plcA的引物和探针，所述引物序列如SEQ ID NO：4
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5所示，所述探针序列如SEQ ID NO：6所示；
[0011]扩增沙门氏菌基因hilA的引物和探针，所述引物序列如SEQ ID NO：7
‑
8所示，所述探针序列如SEQ ID NO：9所示。
[0012]本专利技术还提供一种上述的多重荧光定量PCR引物组在制备鉴定三种食源性致病菌产品中的应用。
[0013]本专利技术还提供一种同时检测食品中三种致病菌的试剂盒，包括上述的多重荧光定量PCR引物组。
[0014]本专利技术还提供一种同时检测食品中三种致病菌的多重荧光定量PCR方法，包括利用上述的多重荧光定量PCR引物组扩增待测样品目标菌株DNA的步骤。
[0015]进一步地，所述扩增的反应体系包括以下组分：2
×
SuperReal
‑
time PreMix 10μL，上下游引物各0.6μL，探针各0.4μL，模板DNA各1μL，ddH2O补足至20μL。
[0016]进一步地，所述扩增的反应程序为：95℃预变性15min；95℃变性3s，60℃退火并延伸30s，40个循环。
[0017]本专利技术还提供一种如上述的多重荧光定量PCR引物组或上述的试剂盒在检测食源性致病菌中的应用。
[0018]本专利技术公开了以下技术效果：
[0019]本专利技术基于TaqMan探针法荧光定量PCR技术，针对食品中致病菌的特异性的致病基因，设计引物和荧光探针，通过优化反应体系和PCR扩增条件，开发出了能同时检测3种致病菌的试剂盒和高通量多重实时荧光定量PCR方法。
[0020]本专利技术提供的乳品致病菌的检测试剂盒包括用于检测产志贺毒素大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌及沙门氏菌的引物对和探针等，能够一次性同时检测待测样品中的产志贺毒素大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌及沙门氏菌这3种致病菌，可以在16
小时以内对待测样品完成检测，大大缩短检测周期，并且检测的灵敏度可达101CFU/mL，具有较高的检测灵敏度。因此，本专利技术所提供的乳品致病菌的检测方法可以一次性同时检测产志贺毒素大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌及沙门氏菌这3种致病菌，表现出耗时短，检测效率高的优势，且可以进行定量检测，能够满足规模化生产的快速检测需求，对有效预防食源性致病菌危害的发生具有重要的实用价值。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测食品中三种致病菌的多重荧光定量PCR引物组，其特征在于，包括如下序列：扩增产志贺毒素大肠埃希氏菌基因wzx的引物和探针，所述引物序列如SEQ ID NO：1
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2所示，所述探针序列如SEQ ID NO：3所示；扩增单核细胞增生李斯特氏菌基因plcA的引物和探针，所述引物序列如SEQ ID NO：4
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5所示，所述探针序列如SEQ ID NO：6所示；扩增沙门氏菌基因hilA的引物和探针，所述引物序列如SEQ ID NO：7
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8所示，所述探针序列如SEQ ID NO：9所示。2.一种权利要求1所述的多重荧光定量PCR引物组在制备鉴定三种食源性致病菌产品中的应用。3.一种同时检测食品中三种致病菌的试剂盒，其特征在于，包括权...

【专利技术属性】
技术研发人员：艾鹏飞，王雁伟，庞艳荣，高辉明，王珊，郭鹏，
申请(专利权)人：河北科技大学，
类型：发明
国别省市：