一种用于白念珠菌检测的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种检测白念珠菌的方法及其应用，涉及肠道真菌检测技术领域，检测步骤为：1)提取DNA：选取样品、DNA提取试剂盒、提取DNA、样本量、设置对照；2)定量检测；将纯菌DNA通过qPCR检测方法，进行绝对定量。3)方法验证：新鲜样本进行分离培养对上述定量检测方法进行验证。本发明专利技术创造性地提出了上述肠道真菌检测方法及模式，该方法及模式精准且耗时短、效率高。率高。率高。

【技术实现步骤摘要】
一种用于白念珠菌检测的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及肠道真菌检测
，尤其涉及一种用于白念珠菌检测的方法及其应用。

技术介绍

[0002]白念珠菌是最常见的肠道共生真菌之一，广泛存在于人群中，在特定致病条件下，失调的白念珠菌与多种肠道疾病如免疫缺陷患者的机会性感染、炎症性肠病、结直肠癌等密切相关，还会影响一系列治疗方法如粪菌移植等的疗效。因此针对肠道真菌可靠且高效的病原学检测方法对防治真菌相关疾病、改善疗效等至关重要。目前白念珠菌等真菌的临床病原学检测及相关疾病的诊断仍依靠对“金标准”分离培养结果进行形态学观察。粪便样本涂片后进行革兰氏染色镜检以观察真菌形态也是可使用的病原学检测方法，但其检测阳性率较低，检测效率和准确性均不能较好地满足临床需求。
[0003]现有真菌检测技术中有关肠道白念珠菌的检测主要涉及以下两种具体的技术手段：DNA提取与Taqman探针qPCR以及分离培养。
[0004]目前，DNA提取及qPCR检测是科学研究中常用的真菌病原学检测方法。随着DNA提取技术的进步，生物样本取材的范围也逐渐拓宽，包括但不限于人体体液、组织、粪便等。qPCR可对所提得真菌基因组DNA进行检测以明确样本中真菌的相对丰度。而自其被专利技术以来，qPCR因其精准、快速、便捷的特点而在临床和科研中广为应用，其中Taqman探针技术是一种经典的qPCR技术，由于其高度的序列特异性、结合专一性，所以释放的荧光信号与扩增拷贝数之间一一对应，且Taqman探针技术仅需设计一条探针，设计优化与操作难度均显著降低。鉴于Taqman探针qPCR灵敏度高、特异性强、易于优化改进等特点，其在微生物分子生物学鉴定领域获得了越来越广泛的认可和应用。此前使用qPCR法检测肠道真菌的研究多围绕炎症性肠病中肠道真菌失调开展，一项有关炎症性肠病患者肠道白念珠菌改变的研究即通过对粪便中提取的白念珠菌DNA进行qPCR检测完成，另一项关注炎症性肠病发病机制与肠道白念珠菌多态性关系的研究也使用了qPCR法来确定实验小鼠肠道白念珠菌含量，然而本专利技术在构思过程中对现存的qPCR检测真菌方法均进行了尝试，发现上述研究的qPCR检测真菌方法均不能很好地适用于临床检测。前者使用染料法qPCR所得融解曲线出现非单一峰，且对qPCR产物进行测序比较，发现其qPCR扩增特异性比较有限、不甚理想，而后者主要针对小鼠粪便进行qPCR检测，由于小鼠和人的种属差异，其设计的引物也不适用于人类的粪便样本检测。
[0005]分离培养则是临床诊治时最常用、最可靠的真菌病原学检测方法，临床实践中仍以分离培养为真菌病原学检测的“金标准”，形态学观察依旧是主要手段。通过对致病真菌的培养，2周内若无菌体生长则为阴性结果，反之则为阳性结果。此类方法的可靠性毋庸置疑，但也存在耗时较长、检出率较低、检测效率不足以满足临床需求等问题，故在实际应用中仍具备改良优化的空间。
[0006]迄今为止，临床中尚无一种简便、快捷、精准、灵敏、具备实践意义和推广价值的检
测方法用于发现特定真菌、诊断相关疾病，上述两种具体技术手段都存在一定的自身局限，因此相关领域的技术人员致力于对现有技术进行创新优化，对各项技术进行综合考量和反复尝试，力求挑选出最为适合准确的检测技术进行组合，取之所长补之所短，建立一种普适、精准且简便的检测方法，以实现利用少量生物样本对白念珠菌进行绝对定量，并希望此方法可以作为白念珠菌病原学检测的辅助方式，辅助多种消化系疾病的诊断与治疗选择，从而提高临床决策的效率和可靠程度，推动临床决策的个性化和精准化。
[0007]同时，人群肠道白念珠菌的准确检测仍鲜有报道，该方向仍有大片空白亟待填补。为数不多的前期学术研究成果也多围绕炎症性肠病和健康对照人群的肠道真菌组成开展，结直肠腺瘤(colorectal adenoma，CRA)或结直肠癌(colorectal carcinoma，CRC)患者的肠道真菌组成鲜有涉及。并且，此前的研究大多通过测序法对人群的肠道白念珠菌分布进行探究，然而由于其自身技术限制，测序法的人类肠道真菌种类鉴别能力不尽如人意。常用的测序方法ITS测序只能精确到真菌属的信息、而无法鉴别不同的真菌种；鉴于肠道真菌的低丰度，宏基因组测序中真菌基因组的信息仅占全部信息的0.01％，较低的丰度导致了测序深度的下降、数据分析无法识别一些低含量的真菌。也正因此，此前对人类肠道白念珠菌的测序分析并未得出较为一致的结果，人群的白念珠菌阳性检测率从40％到80％不等，但目前尚无研究或合适的研究方法对CRA、CRC患者肠道白念珠菌做出准确检测，随着我国CRC发病率的逐渐攀升、CRC新发病率升至第二，CRC患者群体的肠道真菌组成也获得了越来越多的关注，相关研究亟待开展、合适的研究方法亟待建立。
[0008]最后，特定真菌病原学检测方法与模式的建立也对其他真菌检测及诊断模式的建立具有参考价值，可启发相关科研技术人员建立或改进相应方法，推动真菌病原学检测的进步。
[0009]因此，本领域的技术人员致力于开发一种简便、快捷、精准、灵敏、具备实践意义和推广价值的检测方法，建立一种普适、精准且简便的检测方法，以实现利用少量生物样本对白念珠菌进行绝对定量。

技术实现思路

[0010]有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是如何通过对现有技术的改进优化，提供一种简便、高效、精准、灵敏、具备实践意义和推广价值的白念珠菌真菌病原学检测方法，克服现存不足，充分利用少量排泄物样本，如粪便，对其中含有的少量真菌进行准确定量，并对结果可靠性进行验证。
[0011]目前有诸多试剂盒用于提取人体微生物基因组，但对于杂质及宿主基因组等的去除差异大，并且裂解液的强弱程度不同，缺乏特异性及大样本验证，尤其用于真菌检测目前非常少，这对人体中真菌的研究存在强大的桎梏。因此适用于真菌组提取的试剂盒及其方法尤为重要。本专利技术通过选取针对真菌核酸提取的试剂盒结合有效破壁方法，制定高效、稳定、廉价、可推广的真菌核酸提取方法。其次，此外，对于真菌种的检测缺乏特异性的引物，目前已有的文献对于真菌种的检测引物缺乏特异性，并且多数仍为基础研究领域，未涉及人的的粪便标本检测，因此本专利技术在建立人粪便样本提取规范化流程后，进一步的选择高特异性的引物用于特定真菌种的检测，并在三类人群进行大样本的验证，首次发现白色念珠菌在正常人、结直肠腺瘤及结直肠癌腺癌中分布及变化模式，并且此定量得到分离培养
的验证，首次在大人群中精确定量白色念珠菌，为未来临床研究真菌提供有效的方法。这对于未来临床研究真菌与肠癌等疾病相关性尤为关键。
[0012]本专利技术提供了一种用于白念珠菌检测的方法，所述方法包括以下步骤：
[0013]1)提取DNA：选取样品、选取DNA提取试剂盒、选取样本量、设置对照，得到纯菌DNA；
[0014]2)定量检测：将步骤1)得到的样品的DNA通过qPCR检测方法，进行绝对定量；
[0015]3)方法验证：通过分离培养对新鲜样本进行检测，验证步骤2)中qPCR检测方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于白念珠菌定量检测的方法，其特征在于，所述步骤为：1)提取DNA：选取样品、选取DNA提取试剂盒、选取样本量、设置对照，得到纯菌DNA；2)定量检测；将提取的纯菌DNA通过实时荧光定量PCR检测方法，进行绝对定量；3)方法验证：对部分新鲜样本进行传统分离培养对上述定量检测方法进行验证。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述样品为粪便样本；和/或，所述样品的DNA浓度>10ng/μl且OD 260/280比值在1.8至2.0之间。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述绝对定量为：当所述样品为粪便时，采用特异性引物，并规定所述白念珠菌界定值为1*104CFU/g粪便，当检测数量高于所述界定值时，则定义所述白念珠菌阳性。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述特异性引物为：正向引物GCCTTACCACTACCGTCTTTC(SEQ ID NO.1)反向引物ATTGCGCCCTCTGGTATTC(SEQ ID NO.2)；探针FAM
‑
AGGGAGAAACGACGCTCAAACAG(SEQ ID NO.3)。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中所述qPCR检测方法包括对所述纯菌DNA进行梯度稀释随后进行所述qPCR定量，根据真菌绝对数量和CT值之间的关系，构建标准曲线，并以此对所述CT值进行转化、实现qPCR结果的标准化；所述qPCR检测方法的检测指标为样品中的所述DNA的所述CT值对应的所述白念珠菌的含量。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述纯菌DNA进行倍比稀释，随后使用所述qPCR检测方法进行检测，通过对所述纯菌DNA的无限稀释，最终实现一个克隆代表一个真菌，对每克所述粪便中实际含有的真菌数量进行精准定量，并根据所述真菌绝对数量和所述CT值之间的...

【专利技术属性】
技术研发人员：房静远，陈萦晅，李佳璐，谢元鸿，张宸已，冷晓旭，陈慧敏，周澄蓓，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：