基于高通量测序平台的BRCA1/2基因突变检测的引物组、文库构建与环化方法技术

本发明专利技术属于核酸检测技术领域，具体涉及一种基于高通量测序平台的BRCA1/2基因突变检测的引物组、文库构建与环化方法，本发明专利技术专利基于国产高通量测序平台MGI设计，能采用更少的样本使用量、更少的引物对数及摩尔用量、更少的扩增管数、更小的PCR反应体积、更简单的反应体系，简化了样本建库流程、缩短建库时长，达到最优的扩增效果及特异性，不仅样本、引物使用量少，单个样本所需测序数据量低，一定程度上节约了测序成本。并且提供了一种文库构建与文库环化方法，单个样本所需数据量仅为2.5M，即可达到测序数据比对率100％、捕获率大于99％、均一性大于99％，500

【技术实现步骤摘要】
基于高通量测序平台的BRCA1/2基因突变检测的引物组、文库构建与环化方法


[0001]本专利技术属于核酸检测
，具体涉及一种基于高通量测序平台的BRCA1/2基因突变检测的引物组、文库构建与环化方法。

技术介绍

[0002]乳腺癌是中国女性最常见的恶性肿瘤，居癌症相关死因的第5位。研究表明，5％～10％的乳腺癌患者具有明确的遗传基因突变，称之为遗传性乳腺癌(hereditary breast cancer，HBC)，其中BRCA1/2基因突变占15％，其他主要易感基因有TP53、CDH1、LKB1、PTEN、CHEK2、ATM和PALB2等。乳腺癌易感基因包括乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)和乳腺癌易感基因2(breast cancer susceptibility gene 2，BRCA2)，是重要的抑癌基因，其编码产物参与DNA损伤同源性重组修复组(homologous recombination)、基因转录调控和细胞周期调节等。
[0003]传统的Sanger测序是目前国内临床检测BRCA1/2基因突变的主要检测手段，但其普遍存在检测范围小、样本使用量大、引物试剂耗费量大等缺点。而对BRCA1/2全部编码序列及邻近内含子序列检测来说，检测通量较低、周期长，单样本检测费用也较高(成本在600
‑
1000元不等)。此外，市面上也有基于高分辨率熔点曲线分析(High Resolution Melting Analysis，HRM)技术的检测试剂盒，但仅能检测几个已知位点，其作用非常有限。而高通量测序技术(Next
‑
Gene Sequnencing,NGS)能够实现一次实验扩增检测BRCA1和BRCA2两个基因全部编码区的胚系突变，通量高且检测精准。
[0004]目前已有多个基于NGS技术，用于检测人类乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的试剂盒或专利技术专利(包括多重PCR靶向建库技术和特异性探针杂交捕获)。但存在初始样本投入量较高(20ng
‑
50ng不等)、探针费用昂贵，或由于初始扩增管数过多带来的操作繁琐、样本使用量大(40ng
‑
400ng不等)、试剂耗费成本高，以及引物对数较多(97
‑
216对引物不等)或引物投入量大(200μM
‑
400μM)带来的成本增加等问题。

技术实现思路

[0005]为了在现有技术上进一步优化内容，本专利技术提供一组可用于扩增BRCA1基因和BRCA2基因所有转录本的外显子编码区、以及外显子与内含子交界处
±
20bp的引物组，引物组使用量较低，总投入量最低为107.7μM，引物投入摩尔用量在0.1μM
‑
3.0μM之间。
[0006]以及提供一种用于MGI平台文库构建及文库环化方法，适配多种样本类型，仅需6ng样本即可在7h内完成整个建库与环化流程，PCR组分简单、扩增管数少、操作简便，文库环化步骤中，模板变性和引物退火在同一时空中进行，整个反应可在室温下进行，无需担心单链复性，大大提高的文库环的产量，单个样本所需数据量为2.5M，即可达到测序数据比对率100％、捕获率大于99％、均一性大于99％，500
×
测序深度下覆盖度100％。
[0007]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0008]基于高通量测序平台的BRCA1/2基因突变检测的引物组，所述引物组包括分为三组的133对引物对，每对引物对的正向引物和反向引物5
’
端至3
’
端依次包括通用序列和特异性序列；
[0009]第一组引物对的正向引物的特异性序列如SEQ ID NO.1,2,3,4,5
……
44所示，对应的反向引物的特异性序列如SEQ ID NO.134,135,136,137,138
……
177所示；
[0010]第二组引物对的正向引物的特异性序列如SEQ ID NO.45,46,47,48,49
……
89所示，对应的反向引物的特异性序列如SEQ ID NO.178,179,180,181,182
……
222所示；
[0011]第三组引物对的正向引物的特异性序列如SEQ ID NO.90,91,92,93,94
……
133所示，对应的反向引物的特异性序列如SEQ ID NO.223,224,225,226,227
……
266所示。
[0012]进一步的，所述133对引物对的摩尔用量范围如下：
[0013][0014][0015][0016][0017][0018][0019][0020][0021]进一步的，每对引物对的正向引物和反向引物的通用接头序列为与基因测序平台适配的接头序列。
[0022]进一步的，适配于MGI高通量测序平台的每对引物对的正向引物的通用接头序列如SEQ ID NO.267所示，反向引物的通用接头序列如SEQ ID NO.268所示。
[0023]SEQ ID NO.267：TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT；
[0024]SEQ ID NO.268：GAACGACATGGCTACGATCCGACTT。
[0025]本专利技术还提供一种BRCA1/2基因突变检测的文库构建方法，包括以下步骤：
[0026]S1、使用上述的第一组引物对、第二组引物对、第三组引物对分别进行扩增样本基因；
[0027]具体为：将提取好的样本gDNA稀释至2ng，配制3管PCR反应体系分别进行PCR扩增，反应体系1需加入第一组引物对，反应体系2需加入第二组引物对，反应体系3需加入第三组引物。
[0028]S2、将步骤S1的第一组引物对扩增产物、第二组引物对扩增产物和第三组引物扩增产物按照(1
‑
3):(3
‑
7):(5
‑
11)的比例混合后进行纯化，得到纯化后的第一轮PCR扩增产物；优选第一组引物对扩增产物、第二组引物对扩增产物和第三组引物扩增产物的加入量分别为4μL、12μL、20μL。
[0029]S3、以所述第一轮PCR扩增产物为模板进行第二轮PCR扩增反应，目的是为了进一
步增加靶标产物量并加上样本识别标签；
[0030]S4、对第二轮PCR扩增产物进行纯化，得到所述BRCA1/2基因突变检测的文库。
[0031]进一步的，BRCA1/2基因突变检测的文库构建方法具体包括以下步骤：
[0032]进一步的，步骤S1中，样本的类型包括外周血、口腔拭子和宫颈脱落细胞。
[0033]进一步的，步骤S1中，所述引物组的总用量为107.7
‑
134.3μM，优选为121μM。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于高通量测序平台的BRCA1/2基因突变检测的引物组，其特征在于，所述引物组包括分为三组的133对引物对，每对引物对的正向引物和反向引物5
’
端至3
’
端依次包括通用序列和特异性序列；第一组引物对的正向引物的特异性序列如SEQ ID NO.1,2,3,4,5
……
44所示，对应的反向引物的特异性序列如SEQ ID NO.134,135,136,137,138
……
177所示；第二组引物对的正向引物的特异性序列如SEQ ID NO.45,46,47,48,49
……
89所示，对应的反向引物的特异性序列如SEQ ID NO.178,179,180,181,182
……
222所示；第三组引物对的正向引物的特异性序列如SEQ ID NO.90,91,92,93,94
……
133所示，对应的反向引物的特异性序列如SEQ ID NO.223,224,225,226,227
……
266所示。2.根据权利要求1所述的基于高通量测序平台的BRCA1/2基因突变检测的引物组，其特征在于，所述133对引物对的用量范围比例如下表所示：
3.根据权利要求1所述的基于高通量测序平台的BRCA1/2基因突变检测的引物组，其特征在于，每对引物对的正向引物和反向引物的通用接头序列为与基因测序平台适配的接头序列。4.根据权利要求1所述的基于高通量测序平台的BRCA1/2基因突变检测的引物组，其特
征在于，所述高通量测序平台为MGI测序平台，每对引物对的正向引物的通用接头序列如SEQ ID NO.267所示，反向引物的通用接头序列如SEQ ID NO.268所示。5.BRCA1/2基因突变检测的文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、使用权利要求1
‑
4任一项所述的第一组引物对、第二组引物对、第三组引物对分...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘一丁，李佳皓，赵久茗，张丁元，李龑，
申请(专利权)人：成都诺森医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：