一种检测乳腺癌miRNA的电化学生物传感器制造技术

本发明专利技术公开了一种检测乳腺癌miRNA的电化学生物传感器，用于检测目标miRNA，至少包括探针，所述探针包含有G

【技术实现步骤摘要】
3
′
。
[0014]与现有技术相比，本专利技术具有的优点和积极效果是：
[0015]本专利技术设计了一对含有G
‑
四链体片段的生物素化DNA序列作为探针，进行HCR反应。通过链霉亲和素和生物素之间的特异性亲和力识别，形成稳定G
‑
四链体。在第一发夹和第二发夹自主交叉打开的过程中，杂交链式反应可以不断重复，产生大量分裂的G
‑
四链体结构。G
‑
四链体结构与辅因子血红素相互作用，形成具有过氧化物酶活性的DNAyzme分解体系。
[0016]在没有G4连体的环境下，H2O2缓慢氧化银电极，产生较为稳定的电流。当G4成功组装后，形成DNAyzme，催化H2O2快速分解，背景电流迅速下降。而G4的组装数量与HCR反应时间，温度，目标生物标记miRNA的浓度有关。
[0017]越多的miRNA可以激活更多的G4连体
‑
血红素，形成更多的DNAyzme，能更快的催化分解H2O2，所以可以将背景电流的减弱的速率与miRNA进行数学拟合，利用电信号报告miRNA的浓度。
[0018]具体表现在：1、提高病人乳腺癌检测的顺应性；2、减少检测成本；3、增加检测乳腺癌的准确度；4、提供一种生物标志物检测的新思路。
附图说明
[0019]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020]图1为第一发夹结构、第二发夹结构、目标DNA杂交的步骤示意图一。
[0021]图2为专利技术第一发夹结构、第二发夹结构、目标DNA杂交的步骤示意图二；
[0022]图3为本专利技术；
[0023]图4为本专利技术；
[0024]图5为本专利技术；
具体实施方式
[0025]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。
[0026]如图1至5所示，本专利技术设计了一对含有G
‑
四链体片段的生物素化DNA序列作为探针，进行HCR反应。通过链霉亲和素和生物素之间的特异性亲和力识别，形成稳定G
‑
四链体。在发夹H4和H3自主交叉打开的过程中，杂交链式反应可以不断重复，产生大量分裂的G
‑
四链体结构。G
‑
四链体结构与辅因子血红素相互作用，形成具有过氧化物酶活性的DNAyzme分解体系中的。
[0027]在没有G4连体的环境下，H2O2缓慢氧化银电极，产生较为稳定的电流。当G4成功组装后，形成DNAyzme，催化H2O2快速分解，背景电流迅速下降。而G4的组装数量与HCR反应时
间，温度，目标生物标记miRNA的浓度有关。
[0028]越多的miRNA可以激活更多的G4连体
‑
血红素，形成更多的DNAyzme，能更快的催化分解H2O2，所以可以将背景电流的减弱的速率与miRNA进行数学拟合，利用电信号报告miRNA的浓度。其中，H2O2为过氧化氢，DNA表示为脱氧核糖核酸，DNAyzme表示为脱氧核酶，是脱氧核糖核酸和酶的复合物；miRNA：微小核糖核酸。
[0029]其步骤是：
[0030]1、目标DNA设计
[0031]从TCGA数据库中筛选出乳腺癌的差异性表达基因并根据基因序列设计发夹结构。
[0032]2、检测前处理
[0033]所有样品均以10μM制备，保存在300μM NaCl的HEPES(pH 7.0)缓冲液中。每个功能性发夹结构(1μM/次)在使用前加热至95℃ 5分钟，并冷却至室温(25℃)至少2小时。
[0034]3、杂交反应
[0035]用不同浓度的靶DNA孵育，所有样品孵育到测量的间隔时间为6小时。
[0036]4、四链体的组装
[0037]两个发夹结构(附图1
‑
(A)
‑
1/附图1
‑
(A)
‑
2)和目标DNA(附图1
‑
(A)
‑
3)。发夹1在5
‘
的末端编码的序列组成四链体的四分之三，称为结构域Ⅰ；发夹的3
’
端末端序列组成四链体结构的四分之一，称为结构域Ⅱ。结构域Ⅲ和结构域Ⅳ组成连接用的序列，部分互补。结构域Ⅰ、结构域Ⅳ和结构域Ⅲ部分杂交，结构域Ⅱ和结构域Ⅲ、结构域Ⅰ和结构域Ⅳ相连，四个结构域形成稳定的发夹结构。
[0038]发夹2的5'和3'末端被功能化，分别组成四链体结构的四分之一(结构域
Ⅰ’
，即发夹1中的结构域Ⅱ)和四分之三(结构域
Ⅱ’
，即发夹1中的结构域Ⅰ)，并分别与连接序列结构域III'和结构域IV'相连。结构域III'和结构域IV'与结构域Ⅲ和结构域Ⅳ互补。
[0039]结构域Ⅰ和Ⅲ部分杂交可以防止四链体的自组装。
[0040]发夹1上有目标DNA的识别序列，因而目标DNA可以打开发夹1并单独的结构域Ⅳ与结构域Ⅰ。暴露出的结构域Ⅳ打开发夹2，并与结构域
Ⅳ‘
杂交暴露出结构域
Ⅲ’
。
[0041]结构域
Ⅲ’
又打开另一个发夹1，与结构域Ⅲ交叉杂交。交叉杂交暴露新发夹1的结构域Ⅳ，使得此两步骤得以反复进行。在结构域Ⅲ，Ⅳ，
Ⅲ’
和
Ⅳ’
进行链式反应的同时，结构域Ⅰ得以解开和Ⅲ的杂交，并与Ⅱ自行组装形成四链体。链式反应使得大量发夹1和发夹2的结构域Ⅲ，Ⅳ，
Ⅲ’
和
Ⅳ’
形成一条较长的双链DNA，并挂载大量四链体。血红素进入四链体结构组装成为产物DNAyzme。
[0042]示例所用DNA的序列
[0043]发夹1 5
′
AGG GCG GGT GGG TGT TTA AGT TGG AGA ATT GTA CTT AAA CAC CTT CTT CTT GGG T 3
′
。
[0044]发夹2 5
′
TGG GTC AAT TCT CCA ACT TAA ACT AGA AGA AGG TGT TTA AGT TGG GTA GGG CGG G 3
′
。
[0045]目标DNA3 5
′
AGA AGA AGG TGT TTA AGT A 3
′
。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测乳腺癌miRNA的电化学生物传感器，其特征在于，用于检测目标miRNA，至少包括探针，所述探针包含有G
‑
四链体片段的双链DNA序列。2.如权利要求1所述检测乳腺癌miRNA的电化学生物传感器,其特征在于，所述探针包括第一发夹、第二发夹；所述第一发夹有四个结构域，其中在5
‘
的末端编码的
DNA
序列组成四链体的四分之三，形成结构域Ⅰ；在3
’
的末端编码的
DNA
序列组成四链体结构的四分之一，形成结构域Ⅱ；结构域Ⅲ和结构域Ⅳ组成连接用的
DNA
序列互补，结构域Ⅰ、结构域Ⅳ和结构域Ⅲ杂交，结构域Ⅱ和结构域Ⅲ、结构域Ⅰ和结构域Ⅳ相连；所述第二发夹有四个结构域，其中在5'的末端编码的
DNA
序列组成四链体结构的四分之一，形成结构域
Ⅰ’
，在3'的末端编码的
DNA
序列组成四链体的四分之三，形成结构域
Ⅱ’
，结构域
Ⅰ’
、结构域
Ⅱ’
分别与结构域III'和结构域IV'相连，结构域III'和结构域IV'与结构域Ⅲ和结构域Ⅳ互补，结构...

【专利技术属性】
技术研发人员：余其奕，张一东，张越，潘天樾，张文蔚，席尘冰，金俊昌，
申请(专利权)人：余其奕，
类型：发明
国别省市：