一种检测结直肠癌的引物组合物、试剂盒和方法技术

本申请提供了一种检测结直肠癌的引物组合物，其特征在于，包括由SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
一种检测结直肠癌的引物组合物、试剂盒和方法


[0001]本申请涉及基因测序领域，具体地，涉及一种检测结直肠癌的引物组合物、试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的消化道恶性肿瘤之一，威胁着人们的生命健康。近年来，随着经济的快速发展和国民生活质量的不断提高，全球结直肠癌发病率和死亡率均保持上升趋势。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)发布的最新癌症统计报告显示：2020年，全球结直肠癌发病率、死亡率分别上升至第3位、第2位，结直肠癌发病例数、死亡例数分别占全球36种癌症10％、9.4％，并成为男性、女性癌症致死原因的第3位。
[0003]目前，结直肠癌的筛查及早期诊断工具主要有结直肠镜、免疫法粪便隐血试验(FIT)及结肠CT成像技术等，但以上诊断技术存在一定的局限性，不利于大规模推广和应用。通过做结肠镜检，医师在可视镜头下可以完整地检视整个结直肠的情况，对于发现的可疑病变可以取组织活检进一步明确病理诊断。但适用于病变位置较低的患者，在检查过程中结直肠管可能会皱缩，从而导致一定的误差。免疫法粪便隐血试验(FIT)是通过特异性的抗体检测粪便标本中的人体血红蛋白，进而提示可能的肠道病变，FIT成本低但诊断准确性不高，FIT阳性者还需要进行结直肠镜辅助诊断。结肠CT成像技术有着无创的优点且灵敏度较高，但需要严格的肠道准备、检查设备和专业技术人员有限、放射线辐射风险等。因此，暂不推荐适用于大规模的人群筛查，仅推荐用于无法完成结肠镜检查的病例，或作为临床辅助诊断的手段。随着对癌症的研究不断深入，“单基因、单突变、单药模式”并不适用于转移性结直肠癌这类高异质性肿瘤的治疗决策。目前结直肠癌已有众多靶向药获批，需要同时考虑所有基因的突变，分析其相互作用，找到最有效的治疗方案。
[0004]近年来，二代测序(Next
‑
generation sequencing,NGS)作为新的分子生物学技术，因其通量高、灵敏度高、成本低等优势，成为肿瘤基因突变检测和指导临床诊疗的重要手段。多重PCR靶向测序(Multiplex PCR Targeted Sequencing)，是一种将多重PCR技术与二代测序技术相结合的一种靶向捕获测序技术，可针对性极强地鉴定特定区域的遗传变异或遗传多态。然而，多重PCR存在难保证各引物扩增效率一致性、非特异性扩增等问题，限制其广泛应用。多重PCR需要将多对特异性引物混合成一个反应体系，不同引物间的配对和竞争性均会影响整体的扩增效率。一方面，所含引物越多，检测重数越多，扩增效率一致性可能随之降低；另一方面，引物检测重数多也可能导致出现非特异扩增，甚至导致非特异扩增占据主要比例，从而造成检测准确性降低。
[0005]现有的测序方法存在的主要问题有：1.缺乏MSI及化疗位点：《结直肠癌分子检测高通量测序中国专家共识(2021年)》指出结直肠癌必须检测的生物标志物包括：MSI、KRAS(exon2，3，4)、NRAS(exon2，3，4)、BRAFV600E，现有的结直肠癌的高通量测序技术检测内容不全，仅针对基因突变位点设计引物，缺少专家共识中提到必须检测的MSI位点，此外还缺
少化疗及TP53检测，无法对免疫、化疗用药、和预后提供参考。2.现有方法检测耗时长，成本高，且对样本要求高：现有的结直肠癌的高通量测序技术普遍采用杂交捕获法建库，该方法具有探针设计难度低、研发省时的优点；但其操作复杂、检测耗时长(约30h)、成本高(320元)，且对样本投入量(200ng以上)及核酸片段长度(通常500bp为比较合适的长度)要求高，此外杂交捕获法的特异性较差，容易捕获非目标区域。3.多重PCR法难保证扩增效率一致性、容易产生非特异扩增、并且文库浓度低：(1)将杂交捕获法换成多重PCR法面临的最大的难题是多重PCR的扩增效率一致性，由于所含引物越多，检测重数越多，效率一致性可能随之降低；(2)多重PCR法检测条带弱且reads数低，且引物检测重数多可能导致有非特异扩增出现，甚至导致非特异扩增占据主要比例，从而造成检测准确性降低；(3)以RNA为起始模板通过多重PCR法构建文库，存在文库浓度低的问题。

技术实现思路

[0006]本申请提供一种检测结直肠癌的引物组合物，其特征在于，包括由SEQ ID NO:1
‑
212的DNA引物组成的DNA引物组合物，和由SEQ ID NO:213
‑
305的RNA引物组成的RNA引物组合物。
[0007]作为优选，所述DNA引物组合物中，各DNA引物的含量如下所示：
[0008]含量为0.45份的引物：SEQ ID NO:1
‑
2，5
‑
14，19
‑
26，29
‑
38，45
‑
48，53
‑
54，57
‑
68，71
‑
74，79
‑
80，85
‑
88，91
‑
92，95
‑
96，101
‑
102，105
‑
114，119
‑
122，125
‑
126，129
‑
130，139
‑
144，151
‑
156，187
‑
188，191
‑
194，197
‑
200，205
‑
206，209
‑
212；
[0009]含量为1.12份的引物：SEQ ID NO：3
‑
4，17
‑
18，39
‑
42，51
‑
52，163
‑
166，171
‑
176，189
‑
190，195
‑
196，203
‑
204，207
‑
208；
[0010]含量为0.225份的引物：SEQ ID NO：15
‑
16，27
‑
28，49
‑
50，55
‑
56，69
‑
70，75
‑
78，103
‑
104，115
‑
118，127
‑
128，135
‑
138，145
‑
150，159
‑
162，167
‑
170，181
‑
184，201
‑
202；
[0011]含量为2.24份的引物：SEQ ID NO：43
‑
44；
[0012]含量为0.18份的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测结直肠癌的引物组合物，其特征在于，包括由SEQ IDNO:1
‑
212的DNA引物组成的DNA引物组合物，和由SEQ ID NO:213
‑
305的RNA引物组成的RNA引物组合物。2.根据权利要求1的引物组合物，其特征在于，所述DNA引物组合物中，各DNA引物的含量如下所示：含量为0.45份的引物：SEQ ID NO:1
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2，5
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14，19
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26，29
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38，45
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44；含量为0.18份的引物：SEQ ID NO：81
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‑
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‑
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124，131
‑
134，157
‑
158，177
‑
180，185
‑
186。3.根据权利要求1或2所述的引物组合物，其特征在于，所述RNA引物组合物中各RNA引物的含量如下所示：含量为1.37份的引物：SEQ ID NO：213
‑
265；含量为0.68份的引物：SEQ ID NO：266
‑
305。4.一种检测结直肠癌的引物组合物，其特征在于，包括检测DPYD位点的引物，所述引物为SEQ ID NO:5
‑
16的引物。5.根据权利要求4的引物组合物，其特征在于，所述引物分为包括SEQ ID NO:5<...

【专利技术属性】
技术研发人员：李莉，金瑛，王勇斯，郑立宇，潘兆东，温韵洁，李奎，裘宇容，
申请(专利权)人：广州华银医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：