一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白SecG及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白SecG及其制备方法与应用，该重组抗原蛋白SecG的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，该重组抗原蛋白SecG编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术通过质粒构建、诱导表达、亲和层析和交换层析纯化等步骤得到高纯度的抗原蛋白，纯化工艺简单、成本低、可操作性强，经过纯化制备后的抗原具有较高免疫原性和免疫效价，可以用作基因工程亚单位疫苗。作为幽门螺杆菌膜转运蛋白中的重要组成蛋白，抗原蛋白SceG将会成为幽门螺杆菌基因工程疫苗研制过程中最有希望的候选抗原之一。程中最有希望的候选抗原之一。程中最有希望的候选抗原之一。

【技术实现步骤摘要】
一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白SecG及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物制药
，涉及重组抗原蛋白，具体涉及一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白SecG及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)是一种人体胃肠道寄生的条件致病菌，属革兰氏阴性菌，被世界公认与多种消化道疾病，特别是消化性溃疡、慢性胃炎、胃癌及黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤等的发生有着非常密切的联系。幽门螺杆菌感染严重危害人们的健康，而临床上针对于幽门螺杆菌感染的传统治疗方法常用“三联”、“四联”疗法，虽然在一定程度上可以治愈感染，但治疗过程中仍存在着抗生素用药量多，治疗费用昂贵、复发率居高不下等亟待解决的问题。
[0003]经过数十年的科学研究，已有大量的实验证明，免疫接种可以有效预防甚至治疗幽门螺杆菌感染所带来的一系列疾病。1993年Czinn等用猫胃螺旋杆菌裂解物口服免疫小鼠诱导黏膜产生高水平的分泌性IgA(sIgA)，同时发现还可以预防猫胃螺旋杆菌的再感染，首次证实了疫苗的保护作用，随后针对幽门螺杆菌的疫苗被越来越多的学者开始研究。因此疫苗接种有望成为未来预防和治疗幽门螺杆菌感染最有效也是最有前景的手段之一。
[0004]幽门螺杆菌全菌疫苗抗原成分复杂且幽门螺杆菌还存在生产周期长、培养条件苛刻、产量低、易污染等多种问题，因此以幽门螺杆菌全菌制备传统的疫苗存在很多困难。随着分子生物学的不断发展，基因工程疫苗成为了目前的研究热点。现今已有多种幽门螺杆菌不同的基因组或基因被克隆用作幽门螺杆菌基因工程疫苗的研究，其中包括：趋化因子cheA和cheY，鞭毛素基因flaA和flaB，热休克蛋白质基因hspA，尿素酶基因UreA、UreB，空泡毒素基因vacA等。虽然其中有些抗原蛋白能够产生一定的免疫保护作用，但目前都还存在着免疫活性较低、重组表达效率低导致蛋白大量制备困难等问题。因此，对幽门螺杆菌疫苗进一步的研究除了应完善免疫方式和筛选高效无毒佐剂类型外，更主要是开发出多种更加全面有效的免疫抗原，通过多价抗原的组合组成高效的人用幽门螺杆菌疫苗。

技术实现思路

[0005]针对现有幽门螺杆菌全菌疫苗存在的抗原成分复杂且幽门螺杆菌还存在生产周期长、培养条件苛刻、产量低、易污染等问题，以及在幽门螺杆菌基因工程疫苗研发过程中，具有较高免疫活性的抗原蛋白种类较少，现有已知基因的重组抗原普遍免疫效价较低或者难以大量制备等问题，本专利技术的目的是解决上述问题，提供一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白SecG及其制备方法与应用，本专利技术在重组表达的基础上通过镍离子亲和层析和阳离子交换层析两步纯化得到高纯度的抗原蛋白，动物实验表明重组抗原蛋白SecG具有良好的免疫原性，能够诱导高效的黏膜免疫应答，可作为有效的疫苗候选抗原。
[0006]目前生物信息学是生物学研究热点，本专利技术利用对数据库中多种幽门螺杆菌抗原蛋白结构的学习，根据“反向免疫学”原理筛选出针对幽门螺杆菌的一种新型免疫重组抗原
蛋白SecG，SecG是幽门螺杆菌细胞膜上蛋白转位酶的一个亚基成分，通过在膜中经历拓扑反转周期，配合SecA的膜插入脱插入循环来刺激幽门螺杆菌的蛋白质易位。此前尚未有研究表明幽门螺杆菌的SecG蛋白能作为幽门螺杆菌特异性抗原引起机体免疫反应。本专利技术将选定的抗原基因克隆至的蛋白表达载体，重组在工程菌内进行大规模表达，经过纯化制备后的抗原可以用作基因工程亚单位疫苗，纯化工艺简单、成本低、可操作性强。而作为幽门螺杆菌膜转运蛋白中的重要组成蛋白，SceG蛋白也将是幽门螺杆菌基因工程疫苗研制过程中最有希望的候选抗原之一。
[0007]为达到上述目的，本专利技术提供了一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白SecG，所述重组抗原蛋白SecG的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]SEQ ID NO:1SecG基因的氨基酸序列：
[0009]KEYGKSVLDETKTNKELSPLVPATGTLNPTLNPTLNPTLNPLEQAPTNPLMPQQTPKELPKEPLNVPSVESPKQNEKNEKNEKNEKNDAKENGIKGVEKTKENAKTPPTTHQKPKTHAQTNAHTNQKKDEK。
[0010]所述重组抗原蛋白SecG的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。该重组抗原蛋白SecG是通过选择幽门螺杆菌基因组编码蛋白中呈现高特异性的肽段编码基因作为目的基因片段，并将该目的基因片段通过原核表达载体导入宿主细胞中进行表达而制备得到，该目的基因片段具有如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列(下划线部分表示酶切位点)。
[0011]SEQ ID NO:2SecG基因核苷酸序列：
[0012]CCATGGGCAAGGAATACGGCAAAAGCGTGCTGGATGAAACCAAAACCAATAAAGAACTGAGCCCGCTGGTTCCGGCCACCGGTACCCTGAATCCGACCCTGAATCCTACCCTGAATCCAACCCTGAATCCCCTGGAACAGGCCCCGACCAATCCGCTGATGCCGCAGCAGACCCCGAAAGAACTGCCGAAAGAACCGCTGAATGTGCCGAGCGTTGAAAGCCCGAAACAGAATGAAAAAAATGAAAAAAACGAGAAGAACGAGAAGAATGATGCCAAAGAAAATGGTATTAAGGGTGTGGAAAAAACCAAAGAAAATGCCAAAACCCCGCCGACCACCCATCAGAAACCGAAAACCCATGCCCAGACCAATGCACATACCAATCAGAAAAAAGATGAAAAACTCGAG。
[0013]本专利技术还提供了一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白SecG的制备方法，包括以下步骤：
[0014]S1、质粒构建
[0015]将核苷酸序列为SEQ ID NO:2的基因作为目的基因片段，将该目的基因片段连接在表达载体质粒中构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒；
[0016]S2、诱导表达
[0017]将所述重组表达质粒转化至重组蛋白表达的宿主菌中进行诱导表达，收集诱导表达后的菌体，破碎处理后离心并收集上清液；
[0018]S3、产物纯化
[0019]将上清液依次经镍柱亲和层析、阳离子柱交换层析纯化后，获得幽门螺杆菌重组抗原蛋白SecG，所述重组抗原蛋白SecG的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0020]上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白SecG的制备方法，重组表达质粒的构建为本领域的常规操作。本专利技术通过“反向免疫学”原理，设计筛选获得潜在幽门螺杆菌重组抗原蛋白SecG编码氨基酸序列，根据氨基酸序列，进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示目的基因片段，最后将该目的基因片段通过双酶切连接在表达载体质粒中获得重组表达质粒。本领技术人员可以采用常规手段获得重组表达质粒，本专利技术中，步骤S1具体包括以下步骤：...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白SecG，其特征在于：所述重组抗原蛋白SecG的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌重组抗原蛋白SecG，其特征在于：所述重组抗原蛋白SecG编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白SecG的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、质粒构建将核苷酸序列为SEQ ID NO:2的基因作为目的基因片段，将该目的基因片段连接在表达载体质粒中构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒；S2、诱导表达将所述重组表达质粒转化至重组蛋白表达的宿主菌中进行诱导表达，收集诱导表达后的菌体，破碎处理后离心并收集上清液；S3、产物纯化将上清液依次经镍柱亲和层析、阳离子柱交换层析纯化后，获得幽门螺杆菌重组抗原蛋白SecG，所述重组抗原蛋白SecG氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。4.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌重组抗原蛋白SecG的制备方法，其特征在于：所述步骤S1包括以下步骤：S11、筛选获得幽门螺杆菌抗原SecG编码氨基酸序列，根据氨基酸序列，进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得目的基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；S12、对目的基因进行全基因合成，通过Xho I和Nco I的酶切位点连接到表达载体质粒中构建重组表达质粒。5.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌重组抗原蛋白SecG的制备方法，其特征在于：所述步骤S2包括以下步骤：S21、将重组表达质粒转化至表达宿主菌中获得可以表达重组抗原蛋白SecG的重组菌株，对重组菌株进行培养至OD
600 0.6
‑
0.8，再于30
‑
37℃、180
‑
240rpm条件下，使用浓度为0.3
‑
0.5mM异丙基硫代半乳糖苷诱导表达4
‑
8h；S22、将诱导表达后的菌液离心弃去上清液得沉淀菌体，沉淀菌体加入缓冲液A混悬均匀，破碎菌体处理后，离心弃沉淀，上清液经抽滤瓶过0.45μm滤膜抽滤备用。6.根据权利要求3所述的幽门螺杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘开云，李彦，谭润卿，郭刚，刘宇，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：