一株三七根际真菌及运用其制备稀有人参皂苷CK的方法技术

本发明专利技术提供一株三七根际真菌及运用其制备稀有人参皂苷CK的方法，属于医药技术领域。本发明专利技术运用真菌分离方法从三七根际土壤中获得一株三七根际真菌即粉红螺旋聚孢霉（Clonostachys rosea），并用多种培养条件对其进行发酵培养。采用有机溶剂回流提取、柱层析分离纯化、HPLC制备技术、逆流色谱技术等天然产物化学研究手段，并借助核磁共振、质谱、红外光谱、紫外光谱、圆二色谱等波谱结构分析技术，从粉红螺旋聚孢霉发酵菌物中获得稀有化合物人参皂苷CK。本发明专利技术系采用真菌发酵直接生产稀有人参皂苷CK，该方法具有生产步骤简洁、制备时间短，制备过程节能、环保等特征。环保等特征。环保等特征。

【技术实现步骤摘要】
一株三七根际真菌及运用其制备稀有人参皂苷CK的方法

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[0001]本专利技术属于医药
，具体地，涉及一种利用三七根际真菌发酵制备稀有人参皂苷CK的方法及其在制备预防或治疗皮肤老化、癌症、炎症和心肌损伤等疾病的药物及药物组合物中的应用。

技术介绍
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[0002]稀有人参皂苷CK[20
‑
O
‑
β
‑
D
‑
葡萄糖基
‑
20(S)
‑
原人参二醇]，是原人参二醇型人参皂苷在人体内的主要吸收形式和药效实体。该物质对多种肿瘤细胞株具有诱导凋亡的作用，但对正常细胞无明显影响，使稀有人参皂苷CK在抗癌药物的联合应用中能够有效降低化疗药物的不良反应，增强放疗和化疗的效果，降低耐药细胞株的抗药性。此外，稀有人参皂苷CK还具有显著的抗过敏和抗炎、神经保护、抗糖尿病及抗皮肤衰老等多种功效。近年来，随着稀有人参皂苷CK药理活性及其作用机制的深入研究，加速了对该化合物的开发应用进程，加大了对该物质的需求。
[0003]稀有人参皂苷CK在自然界中含量甚微，其主要由天然的二醇型人参皂苷Rb1、Rb2、Rc等经微生物或酶转化所得。然而，采用生物转化制备稀有人参皂苷CK的方法不仅需要制备大量的二醇型人参皂苷作为前体物，还需要筛选出反应能力强的菌株或生物酶，且存在生物反应条件苛刻，反应产物复杂、分离纯化困难等弊端，一定程度上阻碍了稀有人参皂苷CK产业的进一步发展。
[0004]利用微生物代谢生产活性天然产物是一种绿色、环保、高效的制备方式，已广泛应用于医药健康领域。粉红螺旋聚孢霉系生赤壳科Bionectriaceae，螺旋聚孢霉属真菌Clonostachys rosea，常营寄生或腐生于植物根部区域，对植物根部病原菌或根部线虫有寄生作用，常被开发利用于作物根区病害生防剂。
[0005]然而，迄今为止，现有技术中未见有源自三七根际土壤的粉红螺旋聚孢霉的开发利用，未见利用源自三七根际土壤的粉红螺旋聚孢霉发酵制备稀有人参皂苷CK的方法及其应用的相关报道。

技术实现思路
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[0006]本专利技术的目的旨在提供一株三七根际真菌即一株粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)，一种利用三七根际真菌发酵制备稀有人参皂苷CK的方法，以其为活性成分的药物组合物，及其在制备预防或治疗皮肤老化、癌症、炎症和心肌损伤等疾病的药物中的应用。本专利技术的制备方法无需前体物的制备，不依赖于药用植物的生产栽培、不占用土地资源；且该制备方法中的真菌增殖速度快，次生代谢产物较为单一，目标产物分离纯化容易，易于工业化生产，能有效减缓因传统制备方式导致的污染或生态破坏。
[0007]为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案：
[0008]一株三七根际真菌，为分离纯化自三七根际土壤的粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏
编号为CGMCC NO.40327。其菌落形态如图1所示。
[0009]人参皂苷CK的制备方法，利用所述的三七根际真菌在特定的培养条件下发酵培养，代谢产生稀有人参皂苷CK，所述的特定培养条件是指人工固体和液体发酵条件，其固体培养基质为小麦、大麦、大米、小米、高粱、玉米、黎米。
[0010]人参皂苷CK的制备方法，利用所述的三七根际真菌在特定的培养条件下代谢产生稀有人参皂苷CK，该方法包括下述步骤：将三七根际真菌即粉红螺旋聚孢霉进行发酵培养，然后将粉红螺旋聚孢霉的大米或小麦发酵培养物用3倍体积的乙酸乙酯浸提5次，每次5天，提取液减压浓缩得乙酸乙酯粗提物，将该粗提物上硅胶柱层析，用有机溶剂洗脱，得石油醚洗脱部分fraction A；层析柱继续用氯仿:甲醇500:1
‑
10:1梯度洗脱得6个主要部分fraction B
‑
G；其中，fraction D上RP
‑
18柱层析，以甲醇:水1:9
‑
9:1梯度洗脱得6个亚组分fraction D1
‑
D6；其中，fraction D2上硅胶柱层析，氯仿:甲醇20:1得6个部分fraction D 2.1
‑
2.6；fraction D2.4上RP
‑
18半制备柱层析，用乙腈:水55:45洗脱，洗脱液减压、浓缩、干燥得单体化合物稀有人参皂苷CK。
[0011]根据所述的人参皂苷CK的制备方法，其中所述的粉红螺旋聚孢霉的发酵培养采用：先制备马铃薯大米固态培养基，将1000g马铃薯洗净、去皮、切块后置于4000mL纯净水中煮沸20min，冷却、三层纱布过滤，收集滤液定容至5000mL为马铃薯提取液备用；然后称取100g大米置于500mL的广口培养瓶内，每瓶加入150mL马铃薯提取液，透气膜封口后高压蒸汽灭菌30min，121℃，0.105Mpa，冷却备用；将活化好的粉红螺旋聚孢霉接种至马铃薯大米固态培养基内，于25
±
2℃条件下避光，或黑暗光照交替发酵培养40d。
[0012]根据所述的人参皂苷CK的制备方法，其中所述的粉红螺旋聚孢霉的发酵培养采用：将4kg马铃薯洗净、去皮、切块后置于12L纯净水中煮沸20min，冷却、三层纱布过滤；4kg小麦8L纯净水中煮沸2h，三层纱布过滤，将马铃薯滤液与小麦滤液混合并定容至20L，将400g葡糖糖溶于混合液中，调节pH值为6.8得改良马铃薯小麦液体培养基，将配制完成的液体培养基分装于三角瓶内，透气膜封口后高压蒸汽灭菌30min，121℃，0.105Mpa，将活化好的粉红螺旋聚孢霉接种至冷却后的液体培养基内，于25
±
2℃条件下悬浮培养30d。
[0013]本专利技术的任一种人参皂苷CK的制备方法在制备稀有人参皂苷CK中的应用。
[0014]本专利技术的任一种人参皂苷CK的制备方法在制备预防或治疗皮肤老化、癌症、炎症、心肌损伤疾病的药物中的应用。
[0015]本专利技术的任一种人参皂苷CK的制备方法所制备得到的稀有人参皂苷CK在制备预防或治疗皮肤老化、癌症、炎症、心肌损伤疾病的药物中的应用。
[0016]本专利技术的任一种人参皂苷CK的制备方法所制备得到的如下结构式所示的稀有人参皂苷CK，
[0017][0018]本专利技术的利用三七根际真菌发酵制备稀有人参皂苷CK的方法，是利用源自三七根际土壤的三七根际真菌即粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)，保藏编号为CGMCC NO.40327，在一定的培养条件下代谢产生稀有人参皂苷CK。所述的真菌特定培养条件是指人工固体和液体发酵培养。其固体培养基质包括小麦、大麦、大米、小米、高粱、玉米、黎米等。
[0019]其中三七根际真菌分离和鉴定采用：称取三七根际土壤5g，放入盛有45mL无菌水的三角瓶中，振荡20min，此即10
‑1的土壤悬液；逐级稀释至10
‑2、10
‑3、10...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株三七根际真菌，其特征在于，所述的三七根际真菌为分离纯化自三七根际土壤的粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.40327。2.人参皂苷CK的制备方法，其特征在于利用权利要求1所述的三七根际真菌在特定的培养条件下发酵培养，代谢产生稀有人参皂苷CK，所述的特定培养条件是指人工固体和液体发酵条件，其培养基质为小麦、大麦、大米、小米、高粱、玉米、黎米。3.人参皂苷CK的制备方法，其特征在于利用权利要求1所述的三七根际真菌在特定的培养条件下代谢产生稀有人参皂苷CK，该方法包括下述步骤：将三七根际真菌即粉红螺旋聚孢霉进行发酵培养，然后将粉红螺旋聚孢霉的大米或小麦发酵培养物用3倍体积的乙酸乙酯浸提5次，每次5天，提取液减压浓缩得乙酸乙酯粗提物，将该粗提物上硅胶柱层析，用有机溶剂洗脱，得石油醚洗脱部分fraction A；层析柱继续用氯仿:甲醇500:1
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10:1梯度洗脱得6个主要部分fraction B
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G；其中，fraction D上RP
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18柱层析，以甲醇:水1:9
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9:1梯度洗脱得6个亚组分fraction D1
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D6；其中，fraction D2上硅胶柱层析，氯仿:甲醇20:1得6个部分fraction D 2.1
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2.6；fraction D2.4上RP
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18半制备柱层析，用乙腈:水55:45洗脱，洗脱液减压、浓缩、干燥得单体化合物稀有人参皂苷CK。4.根据权利要求2或3所述的人参皂苷CK的制备方法，其特征在于所述的粉红螺旋聚孢霉的发酵培养采用：先制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱宏涛，张颖君，尚佳欢，王东，杨崇仁，
申请(专利权)人：中国科学院昆明植物研究所，
类型：发明
国别省市：