蛋白质颗粒制造技术

本发明专利技术涉及一种分离的蛋白质颗粒，其包含穿孔素或颗粒酶的核心，所述核心被糖蛋白外壳包裹，所述糖蛋白外壳包含血小板反应蛋白

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】蛋白质颗粒
[0001]基金声明
[0002]引发本申请的项目已从欧洲联盟地平线2020研究和创新计划下获得欧洲研究理事会(ERC)的资金(资助协议号670930)。


[0003]本专利技术涉及一种蛋白质颗粒，包含所述蛋白质颗粒的细胞和组合物、一种能够产生工程化蛋白质颗粒的细胞的制备方法、一种分离所述蛋白质颗粒的方法、所述蛋白质颗粒在药物中的用途以及一种利用所述蛋白质颗粒进行治疗的方法。

技术介绍

[0004]利用检查点阻断、肿瘤浸润淋巴细胞或CAR
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T细胞的癌症免疫疗法对特定的癌症亚型产生了重大影响，但免疫疗法对脑癌(特别是胶质母细胞瘤)、食管癌、卵巢癌和胰腺癌等都未成功。与治疗这些和其他类型的癌症相关的挑战包括效应细胞进入肿瘤和免疫抑制肿瘤微环境(TME)。胶质母细胞瘤是一种特别具有挑战性的疾病，并且由于肿瘤位于常规免疫疗法或细胞无法很好地进入的免疫特权部位而具有有限的治疗选择方案。因此，需要能够克服这些挑战的替代免疫疗法。

技术实现思路

[0005]因此，根据本专利技术的第一方面，提供了一种分离的蛋白质颗粒，其包含穿孔素和/或颗粒酶的核心；所述核心被糖蛋白外壳包裹，所述糖蛋白外壳包含血小板反应蛋白
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1(TSP
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1)或其片段其变体或其直系同源物。
[0006]根据本专利技术的另一个方面，提供了一种工程化蛋白质颗粒，其包含具有穿孔素和/或颗粒酶的核心；所述核心被糖蛋白外壳包裹，所述糖蛋白外壳包含血小板反应蛋白或其片段或其变体或其直系同源物；其中，所述颗粒酶和/或血小板反应蛋白是基因修饰的。
[0007]目前已经发现，各种细胞类型的激活，特别是T淋巴细胞或自然杀伤(NK)细胞，导致蛋白质颗粒，本文也称为超分子攻击颗粒，(SMAPs)的释放，其不同于先前从这些细胞的细胞外释放中观察到的脂类形成的外泌体。蛋白质颗粒能够与局部靶细胞结合。一旦结合，SMAPs通常从其核心释放至少一个颗粒酶(即颗粒酶A、B、H、M或K)和一个孔形成蛋白(穿孔素)。酶和孔形成蛋白对其靶细胞(即它们结合的细胞)具有细胞毒性。这最终导致SMAP
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结合细胞的死亡。因此，本专利技术的SMAP可被用于通过杀死与病症相关的适当细胞来治疗或治愈各种疾病或病症。例如，SMAP可能被用于通过杀死恶性肿瘤细胞(例如胶质母细胞瘤)来治疗癌症；或者其可能被用于通过杀死感染细胞来治疗细菌或病毒感染；或者其可能被用于通过直接杀死细菌来用于治疗细菌感染。本专利技术的SMAP也是具有优势的，因为与传统的生物制剂和细胞疗法不同，其不易受恶劣的细胞外环境(例如肿瘤的免疫抑制微环境)的影响，因此非常稳定。
[0008]所述颗粒可以保持细胞外稳定(即不降解/崩解)，例如至少1、2、5、12、24或48小
时，或超过1天。所述颗粒可以保持细胞外稳定1
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5小时或更长时间。所述颗粒可以保持细胞外稳定至少72小时。所述颗粒可以保持细胞外稳定1
‑
5天或更长时间。
[0009]本专利技术第二方面的蛋白质颗粒可以被工程化成与任何球状多肽形成融合多肽。本专利技术第二方面的蛋白质颗粒可以被工程化以形成融合多肽，例如与特异性识别在目标靶细胞上表达的蛋白质(例如受体)的配体(例如靶向肽)。因此，配体使蛋白质颗粒对疾病或病症的细胞具有特异性，并且可以减少/防止可能与使用天然(即非工程)蛋白质颗粒相关的潜在脱靶效应。在一种实施方式中，所述融合多肽包括融合到异源多肽上的血小板反应蛋白。
[0010]所述蛋白质颗粒可以具有小于500nm的直径，例如约1nm至500nm。因此，颗粒可以是球状的。例如，所述蛋白质颗粒的直径可以小于约500nm、小于约400nm、小于约300nm、小于约200nm或小于约150nm、或小于约100nm。所述蛋白质颗粒的直径可以为约80nm至约500nm，或约90nm至约400nm，或约100nm至约300nm，或约50nm至约200nm，或约50nm至约180nm，或约70nm至约180nm，或约70nm至约170nm，或约70nm至约150nm，或约70nm至约140nm，或约90nm至约150nm，或约90nm至约140nm，或约100nm至约130nm，或约110nm至约130nm。在一种实施方式中，所述蛋白质颗粒的直径可为约120nm。所述蛋白质颗粒的直径可以不大于约200nm。优选地，所述蛋白质颗粒不具有大于约150nm的直径。在进一步优选的实施方式中，所述蛋白质颗粒的直径在约50nm和约150nm之间。在一种实施方式中，其中存在多个蛋白质颗粒，例如在组合物或种群中，本文讨论的蛋白质颗粒的尺寸是指在种群/组合物中的蛋白质颗粒平均尺寸。
[0011]本专利技术的蛋白质颗粒可以是分离的蛋白质颗粒，术语“分离的”可以指已经从细胞(诸如NK细胞和T细胞)和细胞结构中分离的蛋白质颗粒，包括外泌体和磷脂质膜。所述蛋白质颗粒可以是细胞外颗粒。在一种实施方式中，所述蛋白质颗粒是从细胞外血浆中获取的。所述蛋白质颗粒可能不是细胞内颗粒和/或可能不是从细胞内血浆中获取的。
[0012]本专利技术的蛋白质颗粒可以是工程化的蛋白质颗粒。本专利技术的蛋白质颗粒可以是工程化和分离的蛋白质颗粒。所述蛋白质颗粒可以在约10％至约100％的纯度范围内起作用。因此，本专利技术的蛋白质颗粒或组合物的纯度可以是约10％至约100％、约20％至约100％、约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％或约90％至约100％。在一种实施方式中，所述蛋白质颗粒被分离至至少约90％的纯度；优选地，所述蛋白质颗粒或蛋白质颗粒的组合物基本上是纯的。然而，在一些实施方式中，所述蛋白质颗粒组合物中可能存在少量杂质，例如外泌体。可能存在少于30％的外泌体。优选地，存在少于20％或更优选为少于10％的外泌体。所述分离的蛋白质颗粒可能不含细胞。
[0013]蛋白质颗粒的核心可能包含颗粒酶。颗粒酶是指细胞毒性丝氨酸蛋白酶的家族，其能够裂解细胞外和细胞内的蛋白质。颗粒酶存在于淋巴细胞(特别是细胞毒性T细胞和自然杀伤(NK)细胞)的分泌溶酶体中。它们通过细胞外泌被释放，但通常必须进入靶细胞的细胞质以裂解细胞内蛋白质并诱导细胞死亡。
[0014]在人类中，颗粒酶家族有五个成员，它们被称为颗粒酶A、B、H、M和K。人类颗粒酶A、B、H、M和K能够诱导细胞死亡。颗粒酶A以线粒体依赖性方式诱导靶细胞死亡。颗粒酶A前体的多肽序列长为262个氨基酸，在本文中由SEQ ID NO.1提供，如下所示。
[0015][0016]SEQ ID NO.1中粗体的氨基酸对应信号肽。SEQ ID NO.1中下划线的氨基酸对应颗粒酶A前肽的氨基酸，氨基酸29至262对应颗粒酶A的多肽链。
[0017]在所有颗粒酶中，颗粒酶B是最具特征性的。它诱导靶细胞的程序性细胞死亡(细胞凋亡)。细胞凋亡是通过激活线粒体/半胱天冬酶依赖本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分离的蛋白质颗粒，其包含穿孔素和/或颗粒酶的核心；所述核心被糖蛋白外壳包裹，所述糖蛋白外壳包含血小板反应蛋白
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1(TSP
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1)或其片段、其变体或其直系同源物。2.一种工程化蛋白质颗粒，其包含穿孔素和/或颗粒酶核心的工程化蛋白质颗粒；所述核心糖蛋白外壳包裹，所述糖蛋白外壳包含血小板反应蛋白或其片段、其变体或其直系同源物；其中，所述颗粒酶和/或所述血小板反应蛋白为遗传修饰的。3.根据权利要求1或2所述的蛋白质颗粒，所述蛋白质颗粒包含颗粒酶A、B、H、M和/或K，或其变体或其片段或其直系同源物。4.根据权利要求1、2或3所述的蛋白质颗粒，其中，所述外壳包含基本上如SEQ ID NO.1、2、3、4和/或5的多肽链或其变体或其片段或其直系同源物中所示的成熟多肽序列。5.根据前述任意一项权利要求所述的蛋白质颗粒，其中，所述穿孔素包含基本上如SEQ ID NO.6或其变体或其片段或其直系同源物中所示的多肽序列。6.根据前述任意一项权利要求所述的蛋白质颗粒，其中，所述糖蛋白外壳不是细胞质膜或磷脂/胆固醇膜。7.根据前述任意一项权利要求所述的蛋白质颗粒，其中，所述TSP
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1包含基本上如SEQ ID NO.9或其变体或其片段或其直系同源物中所示的多肽序列。8.根据前述任意一项权利要求所述的蛋白质颗粒，其中，所述外壳还包括血小板反应蛋白家族的其它成员；例如TSP
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2、TSP
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3、TSP
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4和/或TSP
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5。9.根据前述任意一项权利要求所述的蛋白质颗粒，其中，所述TSP
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4的多肽序列基本上如SEQ ID NO.12或其变体或其片段或其直系同源物所示。10.根据前述任意一项权利要求所述的蛋白质颗粒，其中，所述外壳还包括半乳糖凝集素
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1和/或半乳糖凝集素
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7。11.根据权利要求10所述的蛋白质颗粒，其中，所述半乳糖凝集素
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1的多肽序列基本上如SEQ ID NO.15或其变体或其片段或其直系同源物中的成熟多肽链所示。12.根据权利要求10所述的蛋白质颗粒，其中，所述半乳糖凝集素
‑
7的多肽序列基本上如SEQ ID NO.17或其变体或其片段或其直系同源物中的成熟多肽链所示。13.根据前述任意一项权利要求所述的蛋白质颗粒，其中，所述蛋白质颗粒附着在包含FasL的膜囊泡/磷脂颗粒上。14.根据前述任一项权利要求所述的蛋白质颗粒，其中，所述蛋白质颗粒的外壳和/或核心还包含毒素，例如氯毒素。15.根据权利要求14所述的蛋白质颗粒，其中，所述氯毒素包含基本上如SEQ ID NO.22或其变体或其片段或其直系同源物中所示的多肽序列。16.根据前述任意一项权利要求所述的蛋白质颗粒，包括基因修饰的壳蛋白(例如基于糖蛋白壳中蛋白质的融合蛋白)、基因修饰的核蛋白质(例如颗粒酶)、转基因蛋白质(例如转基因配体)和/或其抗体或其片段。17.根据权利要求16所述的蛋白质颗粒，其中，所述基因修饰的壳蛋白为血小板反应蛋白融合蛋白、半乳糖凝集素融合蛋白(例如半乳糖凝集素
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1融合蛋白)和/或颗粒酶融合蛋白(例如颗粒酶B融合蛋白)。18.根据权利要求17所述的蛋白质颗粒，其中，所述融合蛋白包括抗体或抗体片段；例如scFv、VL和/或VH、Fd、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fc片段、抗体模拟物或双特异性抗体。
19.根据权利要求17或18所述的蛋白质颗粒，其中，所述血小板反应蛋白融合蛋白为TSP
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1融合蛋白或TSP
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4融合蛋白。20.根据权利要求19所述的蛋白质颗粒，其中，所述TSP
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1融合蛋白为TSP
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1/T1
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scFv融合蛋白、Tl
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scFv/TSP
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1融合蛋白、TSP
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1/氯毒素融合蛋白或氯毒素/TSP
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1融合蛋白。21.根据权利要求16所述的蛋白质颗粒，其中，所述抗体或其片段为scFv、VL和/或VH、Fd、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fc片段、抗体模拟物或双特异性抗体。22.根据权利要求1
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21中任意一项所述的能够产生工程化蛋白质颗粒的修饰细胞，所述修饰细胞包括，或包含的核酸编码为：
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穿孔素和/或颗粒酶；
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血小板反应蛋白
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1(TSP
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1)或其片段、其变体或其直系同源物；和
·
异源多肽，例如具有血小板反应蛋白、半乳糖凝集素或颗粒酶的融合蛋白形式的转基因配体。23.根据权利要求1
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21中任意一项所述的能够产生蛋白质颗粒的修饰细胞，其中，所述修饰细胞包括，或包含的核酸编码为：
·
穿孔素和/或颗粒酶；
·
血小板反应蛋白
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1(TSP
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1)或其片段、其变体或其直系同源物；其中，所述穿孔素、颗粒酶和/或TSP
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1是重组的。24.根据权利要求22或23所述的细胞，其中，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：牛津大学创新公司，
类型：发明
国别省市：