一种利用qPCR同步检测基因修饰小鼠骨髓移植嵌合率的方法技术

本发明专利技术涉及骨髓移植研究领域，具体涉及一种利用qPCR同步检测基因修饰小鼠骨髓移植嵌合率的方法，包括如下步骤：A、获取骨髓移植后的各样品组(T)的目的基因所得CT值均数CT

【技术实现步骤摘要】
一种利用qPCR同步检测基因修饰小鼠骨髓移植嵌合率的方法


[0001]本专利技术涉及骨髓移植研究领域，具体涉及一种利用qPCR同步检测基因修饰小鼠骨髓移植嵌合率的方法。

技术介绍

[0002]小鼠骨髓移植模型最早于20世纪60年代建立。骨髓移植(Bone marrow translation，BMT)目前是白血病的主要治疗方法。骨髓研究领域高度依赖于体内实验，因为体外技术无法模拟这些复杂的体内系统。在致死剂量以下的辐射可以清除受体的骨髓基质细胞,该模型已被广泛用于宿主受体小鼠供体造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSC)生物学的研究。小鼠骨髓移植模型是造血干细胞研究不可缺少的基础。造血干细胞在心血管疾病及炎症与免疫相关的疾病中发挥重要作用。无论是在基础研究还是在临床研究中，骨髓移植已经成为治疗造血系统疾病或研究免疫细胞功能的重要策略与方法。总体而言，实验动物骨髓移植模型该技术在效率和成本效益方面具有很大优势，而小鼠更是具有饲养空间要求小及具有各种基因修饰模型的优势，利用其进行的骨髓移植有望继续成为心血管及炎症与免疫相关研究工作的关键技术。
[0003]在科学研究过程中，小鼠骨髓移植后嵌合率是一个评价骨髓移植情况的重要指标。目前多数实验是利用小鼠骨髓移植后骨髓细胞差异，通过荧光标记后，进行流式分析，或者通过实时荧光定量PCR技术，检测雌雄供受体间基因型差异来获得小鼠骨髓移植的嵌合率。上述常用的方法中，通过流式细胞仪分析的方法，通常是将CD45.1标记的C57BL/6小鼠骨髓细胞移植入经辐照的CD45.2小鼠体内，然后通过流式细胞仪分析骨髓移植后小鼠的骨髓和血液中CD45.1标记的细胞的数量，计算获得小鼠的骨髓嵌合率。另一种方法，则是通过雄雌供配体之间基因型的差异，通过将雄鼠骨髓细胞移植到经辐照的雌鼠体内，或将雌鼠骨髓细胞移植到经辐照的雄鼠体内，通过基因型的差异，利用实时荧光定量PCR检测小鼠骨髓移植后供体细胞的移植情况，计算出嵌合率。亦或是通过C57BL/6J小鼠(H
‑
2Kb+/H
‑
2Kd
‑
)作为细胞移植的受体鼠，BABL/c小鼠(H
‑
2Kb
‑
/H
‑
2Kd+)作为细胞移植的供体鼠，然后通过流式细胞仪分析具体的嵌合率。
[0004]现有技术都需要重新造一批模型来模拟原本的实验，计算出该实验过程的嵌合率。这就导致了以下的缺点：一、无法对近交系特定基因敲除小鼠的骨髓移植进行检测；二、增加了额外的实验量及实验动物用量；三、减少了实验的准确性；四、增加了实验的经费；五、增加了实验的时间。
[0005]以上问题的出现是因为在以往的实验中，人们研究的主要方向是移植物抗宿主病等的实验，在该实验过程中，人们只需要鉴别出移植是否成功和雄雌供受体间或异基因移植对结果的影响不大，因此常用雄雌差异或其他更为容易检测的普通基因差异，进行嵌合率方面的计算，但此时获得的嵌合率并不是特定目的基因的嵌合率。然而，随着研究的深入，我们的研究已经不限于对异基因小鼠的研究，实际操作过程中，我们使用的小鼠多为基因修饰的小鼠，这样近交系特定基因敲除小鼠的移植具有各种基因修饰模型的优势，利用
其进行的骨髓移植有望继续成为心血管及炎症与免疫相关研究工作的关键技术。在实验过程中，嵌合率是一个很重要的评价骨髓移植效率的指标，对于嵌合率的计算，无法直接准确的针对该次实验的结果进行计算，需要额外增加实验，选择特定的小鼠进行骨髓移植，再计算嵌合率，这样也就增加了工作量和小鼠用量，也会因为基因型的差异，无法有效的反应出原实验小鼠真实的嵌合率，同时也会增加实验过程中经费的使用。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于，解决现有技术无法在开展基因修饰小鼠骨髓移植正式实验时同步获得移植的嵌合率，实验动物用量大、操作复杂等问题，提供一种利用qPCR(实时定量PCR)同步检测基因修饰小鼠骨髓移植嵌合率的方法。与以往实验技术及计算方法相比，我们的技术可以大大减少实验动物的使用数量，更符合动物学伦理，实验技术简单易操作，不用通过繁琐的实验设计，相对而言，我们的计算方法也更简单可靠，可大大便利针对基因修饰小鼠骨髓移植模型的推广和使用，降低实验的成本。
[0007]为了解决上述现有技术存在的问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种利用qPCR同步检测基因修饰小鼠骨髓移植嵌合率的方法，包括如下步骤：
[0009]A、获取骨髓移植后的各样品组(T)的目的基因所得CT(qPCR扩增达到检测阈值时的循环数)值均数CT
T目的
；
[0010]B、获取各样品组所述目的基因各自对应的内参基因所得CT值CT
T内参
；
[0011]C、将所述CT
T目的
减去所述CT
T内参
，获得ΔCT
T
；
[0012]D、获取未做处理的对照组(C)所述目的基因所得CT值均数CT
C目的
；
[0013]F、获取对照组所述目的基因各自对应的内参基因所得CT值CT
C内参
；
[0014]G、将所述CT
C目的
减去所述CT
C内参
，获得ΔCT
C
；
[0015]H、将所述ΔCT
T
减去所述ΔCT
C
，获得ΔΔCT；
[0016]I、通过计算2^
‑
ΔΔCT
获得相对表达率；
[0017]J、通过所述相对表达率获得嵌合率。
[0018]本专利技术在基因修饰小鼠骨髓移植的模型中，通过供受体之间的基因差异分析，利用差异基因挑选适合的内参基因，并设计相对应的引物，在实验后期，取少量小鼠血液提取基因，通过实时荧光定量PCR技术，测定目的基因的含量，利用我们更新的更简便的计算方法，，算出最终的嵌合率。不同于常规的实验方法，需要重新造一批小鼠模型，或是通过雌雄供配体间基因型差异，又或是通过种属差异来得到小鼠骨髓移植嵌合率，实验结果准确，可信度高，重复性高。
[0019]优选的，所述目的基因包括EP3、Zfy1、COX
‑
1中的一种或多种。
[0020]优选的，所述目的基因的引物对如下：
[0021]EP3F5
’‑
CAACCTGGCGACCATCAAAGC
‑
3'
[0022]R5
’‑
CCGTCTCCGTGGTGATTCTGC
‑
3'；
[0023]Zfy1F5
’‑
TGGAGAGCCACAAGCTAACCA
‑3’
[0024]R5
’‑
CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC
‑3’
；
[0025]COX
‑
1R5
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用qPCR同步检测基因修饰小鼠骨髓移植嵌合率的方法，其特征在于，包括如下步骤：A、获取骨髓移植后的各样品组目的基因所得CT值均数CT
T目的
；B、获取各样品组所述目的基因各自对应的内参基因所得CT值CT
T内参
；C、将所述CT
T目的
减去所述CT
T内参
，获得ΔCT
T
；D、获取未做处理的对照组所述目的基因所得CT值均数CT
C目的
；F、获取对照组所述目的基因各自对应的内参基因所得CT值CT
C内参
；G、将所述CT
C目的
减去所述CT
C内参
，获得ΔCT
C
；H、将所述ΔCT
T
减去所述ΔCT
C
，获得ΔΔCT；I、通过计算2^
‑
ΔΔCT
获得相对表达率；J、通过所述相对表达率获得嵌合率。2.如权利要求1所述，利用qPCR同步检测基因修饰小鼠骨髓移植嵌合率的方法，其特征在于，所述目的基因包括EP3、Zfy1、COX
‑
1等中的一种或多种。3.如权利要求2所述，利用qPCR同步检测基因修饰小鼠骨髓移植嵌合率的方法，其特征在于，所述目的基因的引物对如下：EP3 F5
’‑
CAACCTGGCGACCATCAAAGC
‑
3'R5
’‑
CCGTCTCCGTGGTGATTCTGC
‑
3'；Zfy1 F5
’‑
TGGAGAGCCACAAGCTAACCA
‑3’
R5
’‑
CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC
‑3’
；COX
‑
1 R5
’‑
GCAGCCTCTGTTCCACATACAC
‑3’
R5
’‑
CCCCCATCTCTATCATACTTTCTCC
‑3’
。4.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘斌，余钢，冷静，陈锡坚，郭锦伟，葛佳辉，谢恺麒，周应毕，
申请(专利权)人：汕头大学医学院，
类型：发明
国别省市：