一种抗体偶联物及其制备方法技术

本发明专利技术公开一种抗体偶联物及其制备方法,该抗体偶联物的制备方法包括：抗体还原步骤，将抗体与还原剂在第一反应条件下进行还原反应，以使抗体二硫键进行还原产生巯基，得到还原产物，其中第一反应条件包括：第一反应温度4℃

【技术实现步骤摘要】
一种抗体偶联物及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种抗体偶联物及其制备方法。

技术介绍

[0002]牛樟芝是一种昂贵的蘑菇，生长在中国台湾一种濒临灭绝的本土树种的内腔，即常绿阔叶大乔木牛樟树(Cinnamomum kanehi rai Hayata)的内腔。牛樟芝在中国台湾一直被用作传统药物，并且已知具有多种健康益处，包括清除自由基、抗炎、抗菌、保肝、神经保护、抗糖尿病和自由基诱导的DNA损伤保护活动。牛樟芝乙醇提取物已显示可以触发大鼠成纤维细胞的生长并参与伤口愈合。在人类白血病的情况下，它已显示可以通过在G1期诱导细胞周期停滞来防止肿瘤进展。牛樟芝可储存大量活性化合物，包括萜类、苯类、木脂素、苯醌衍生物、琥珀酸和马来酸衍生物、多醣、甾醇、核苷酸、脂肪酸等。主要在牛樟芝子实体中发现的大多数活性化合物是萜类化合物，并且已经进行了许多研究来评估这组特定化合物的生物学和药理学特性。然而，尽管有许多健康益处，但由于非常缓慢的自然生长速度和子实体的宿主特异性，难以大规模生产这些化合物作为天然药物。子实体的这些特殊特征需要识别菌丝体中丰富的其他化合物，并且可以通过人工培育牛樟芝大规模生产。
[0003]安卓奎诺尔(Antroquinonol)是一种四氢泛醌衍生物，主要存在于牛樟芝菌丝体中，具有多种生物和药理活性。迄今为止，在牛樟芝中已鉴定出7种蒽醌及其相关化合物，包括蒽醌、蒽醌B、C、D、L、M和4
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乙酰蒽醌B。牛樟芝人工发酵过程中的化学全合成和生物合成两种主要的生产蒽醌醇的方法。对蒽醌的生物合成研究表明，由乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A通过聚酮化合物途径形成的山梨酸是牛樟芝天然合成蒽醌的不可缺少的苯醌环前体。敲除牛樟芝中的邻苯二酸合成酶(orsel l inic acid synthase)已被证明可以防止安卓奎诺尔的生物合成。目前已经进行了几项研究来评估这种化合物在治疗许多疾病方面的功效，包括糖尿病、肝脏和肾脏疾病、神经退行性疾病和癌症、以及许多临床试验来评估蒽醌治疗高胆固醇血症、高脂血症、转移性胰腺癌和非小细胞肺癌的安全性和有效性。
[0004]牛樟芝的传统健康益处，已经进行了许多研究来探索其针对各种生理和病理条件的生物学特性。在许多治疗功能中，牛樟芝提取物对肿瘤生长和转移的影响已被广泛研究。例如，牛樟芝发酵培养液已显示通过诱导G1期细胞周期停滞来抑制乳腺癌细胞增殖。该治疗还显示可以推迟注射了乳腺癌细胞的裸鼠的肿瘤发展。此外，卵巢癌的剂量依赖性减少在牛樟芝处理后也观察到细胞生长。实验结果表明，牛樟芝通过抑制HER2磷酸化和抑制PI3K/AKT信号通路发挥抗增殖作用。由于牛樟芝粗提物的生物活性主要取决于其生物活性化合物，因此还强调了单个化合物对癌症进展的影响。在这些生物活性化合物中，蒽醌因具有健康益处和相对容易的生物合成过程而受到科学界的特别关注。在包括肺癌、肝癌和白血病在内的许多癌细胞中，蒽醌已被证明通过抑制Ras和其他Ras相关的小GTP结合蛋白(Rho)发挥抗癌作用。从机制上讲，antroqu inono l已显示通过直接结合法尼基转移酶和香叶基香叶基转移酶
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I并随后抑制这些酶的生物学功能来改变这些蛋白质的翻译后修饰。这导致癌细胞中未加工的Ras和相关蛋白质的产生和积累。蒽醌和法尼基转移酶之间的相
互作用模式，分子对接分析表明类异戊二烯antroqu inono l的部分与法呢基转移酶的疏水腔结合，并且antroqu inono l的环结构位置靠近法呢基转移酶上的Ras
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CAAX基序结合位点。蒽醌通过增加LC3B
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1向LC3B
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I I的转化以及提高肺癌细胞中LC3B
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I I相关自噬体的水平来诱导自噬途径。
[0005]抗体药物具有高度的特异性，从1960年开始，人们开始了利用抗体进行肿瘤治疗。最初人们采用小鼠的单抗进行试验，但是由于免疫原性，血清半衰期短和缺乏与人类免疫效应细胞有效的互动，进展十分有限。因此，人们开始采用人源化抗体，这样的抗体可以通过蛋白质工程生产，人源化单抗药物发挥治疗作用的关键就是对特定的单一抗原表位。然而目前临床使用的抗体药物存在诸多不足，如完整的抗体分子由于其分子量大而穿透性差，难以穿过结缔组织而达到实体肿瘤部位。另外，临床使用剂量大，生产成本高昂，因而导致患者难以承受。同时出现肿瘤细胞群体的抗原异质性，以及靶细胞的抗原调变影响单抗药物疗效等。采用互补决定区移植术或者通过噬菌体，酵母或核糖体表达生产人源化抗体。和鼠抗相比，人源化抗体免疫原性降低，而且对肿瘤细胞的杀伤能力更强。提高抗体药物在肿瘤细胞内的浓度可以通过提高单抗药物的通透性的方法来解决。通常来说，完整的抗体的循环周期长，通常能有几天到一周的时间，但是，由于完整的抗体分子很大，分子量150kDa，导致它很难透过细胞外间隙或者毛细管皮层达到肿瘤细胞内部，因此它不是在体内组织传递的最佳形式。通过放射性免疫偶联物液闪法对不同大小的抗体片段进行研究表明，低分子量的抗体片段显示了很好的细胞穿透性，而且在组织中的分布更均匀。使用低分子量的抗体片段，还可以减少人体内的抗体反应。因此，小型化抗体的研究对提高抗体药物的疗效有着重要的意义。
[0006]抗体药物偶联物的制备方法涉及抗体氨基酸残基的随机修饰和将药物分子选择性地引入到抗体分子上。其中的随机修饰过程包括对羧酸进行氨基化，赖氨酸侧链的氨基进行酰基化等。抗体分子含有很多可用来修饰交联的基团，交联基团有氨基和羧基，氨基可以是赖氨酸侧链的s氨基和抗体N末端的氨基。羧基通常是使用碳末端以及天门冬氨酸和谷氨酸残基。氨基和羧基在抗体和大部分蛋白中广泛存在，利用这些基团进行偶联将会随机的交联抗体分子的各个部分，这将导致抗体药物偶联位点的随机性，也常常会阻塞蛋白分子的抗原结合位点，从而导致抗体药物偶联物活性的降低。

技术实现思路

[0007]因此，本专利技术所要解决的是如何改善现有的抗体偶联物的制备方法中抗体偶联物活性降低的问题。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术还提供一种抗体偶联物的制备方法，所述抗体偶联物的制备方法包括：
[0009]抗体还原步骤，将抗体与还原剂在第一反应条件下进行还原反应，以使抗体二硫键进行还原产生巯基，得到还原产物，其中第一反应条件包括：第一反应温度4℃
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37℃，第一反应pH为4
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11，所述还原剂与所述抗体的摩尔比为2
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11；
[0010]抗体与药物偶联步骤，向所述还原产物中加入牛樟蒽醌在第二反应条件下偶联反应，得到抗体偶联物，其中第二反应条件包括：第二反应温度为37℃，第二反应pH为6.9
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8.9，还原产物与牛樟蒽醌的摩尔比例为4.34
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6.14。
[0011]优选地，在所述抗体偶联物的制备方法中，所述抗体与药物偶联步骤包括：
[0012]将牛樟蒽醌溶解在有机溶剂中，再加入所述还原产物中在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗体偶联物的制备方法，其特征在于，包括：抗体还原步骤，将抗体与还原剂在第一反应条件下进行还原反应，以使抗体二硫键进行还原产生巯基，得到还原产物，其中第一反应条件包括：第一反应温度4℃
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37℃，第一反应pH为4
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11，所述还原剂与所述抗体的摩尔比为2
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11；抗体与药物偶联步骤，向所述还原产物中加入牛樟蒽醌在第二反应条件下偶联反应，得到抗体偶联物，其中第二反应条件包括：第二反应温度为37℃，第二反应pH为6.9
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8.9，还原产物与牛樟蒽醌的摩尔比例为4.34
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6.1。2.如权利要求1所述的抗体偶联物的制备方法，其特征在于，所述抗体与药物偶联步骤包括：将牛樟蒽醌溶解在有机溶剂中，再加入所述还原产物中在第二反应条件下偶联反应，得到抗体偶联物。3.如权利要求2所述的抗体偶联物的制备方法，其特征在于，所述第二反应条件包括：第二反应温度为37℃，第二反应pH为7
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8。4.如权利要求1或2所述的抗体偶联物的制备方法，其特征在于，所述第一反应温度为37℃，所述第一反应pH为7
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8。5.如权利要求1或2所述的抗体偶联物的制备方法，其特征在于，所述抗体与药物偶联步骤之前...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹国靖，戴镕骏，李玉梅，张平，李家国，
申请(专利权)人：厦门遇见今生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：