本发明专利技术涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种稳定的I型重组胶原蛋白及其应用。所述I型重组胶原蛋白由来自天然人I型胶原蛋白的短氨基酸序列作为重复单元进行多次重复而构成，其中，所述短氨基酸序列为GFPGER，重复次数为20～120次。所述I型重组胶原蛋白具有极其良好的亲水性及稳定性，其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，应用于人体当中不会造成免疫排斥，可以应用于制备皮下填充剂、人工骨、人工皮肤、口腔可吸收生物膜、骨植入剂、骨修复支架等组织工程材料中。修复支架等组织工程材料中。修复支架等组织工程材料中。
【技术实现步骤摘要】
一种稳定的I型重组胶原蛋白及其应用
[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种稳定的I型重组胶原蛋白及其应用。
技术介绍
[0002]胶原蛋白是哺乳动物中最重要和最丰富的蛋白质之一，在人体的皮肤、结缔组织和骨骼以及其它组织中发现的结构蛋白。在人体内胶原蛋白的含量约为总蛋白质的30％。由于I型胶原在肌腱、软骨和骨等组织中的的广泛存在，又是细胞外基质的骨架，并且可促进骨髓间充质干细胞黏附和成骨分化，因此是当下研究的热点之一。由于I型胶原缺少特殊的专一的整合素受体，因此限制了其介导的细胞应答反应。并且由于存在多余的天然基质蛋白，往往会干扰想要的细胞应答，也有可能会产生对抗的级联反应信号，带来的不利的结果。
[0003]而与I型胶原的全长基质分子相比，GFPGER是其与细胞整合素受体α2β1特异性结合的三螺旋序列，也有促进细胞黏附、增殖和成骨的功效，还可以减少许多不必要的反应。
[0004]现阶段，胶原蛋白主要从动物组织中提取得到，然而来源于动物组织的材料都存在病毒感染的风险，如疯牛病等；同时，由于动物个体的差别导致胶原蛋白的批间稳定性很差。随着基因工程技术的发展，已经有研究采用基因工程手段来表达重组人I型胶原蛋白。
[0005]已知人胶原蛋白发生降解的原因是其氨基酸序列中含有较多的易发生水解的位点。因此，技术人员通过选择来自天然人胶原蛋白的短氨基酸序列进行重复来构建重组胶原蛋白，以期回避易发生水解的位点，从而提高胶原蛋白的稳定性，同时还能保持天然人胶原蛋白的优良性能。
[0006]但是，通过来自天然人胶原蛋白的短氨基酸序列重复构建的重组胶原蛋白，其氨基酸组成及分布都相对单调，理论上讲，这会造成其表面的电荷负载大，整体不容易达到稳定的平衡状态，因而在水溶液中容易水解、变性，且存在短氨基酸序列重复单元越短、重复次数越多，重组胶原蛋白分子在水溶液中越不稳定的倾向，因此，如何获得适合替代天然人胶原蛋白用作组织工程材料的胶原蛋白成为本
的限制性问题。
技术实现思路
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种稳定的I型重组胶原蛋白及其应用。
[0008]第一方面，本专利技术提供一种稳定的I型重组胶原蛋白，由来自天然人I型胶原蛋白的短氨基酸序列作为重复单元进行多次重复而构成，其中，所述短氨基酸序列为GFPGER，重复次数为20～120次。
[0009]第二方面，本专利技术提供编码所述I型重组胶原蛋白的基因。
[0010]第三方面，本专利技术提供含有所述基因的重组工程菌。
[0011]第四方面，本专利技术提供所述重组工程菌的表达产物，所述表达产物为所述I型重组胶原蛋白。
[0012]第五方面，本专利技术提供所述I型重组胶原蛋白或所述表达产物在制备组织工程材料中的应用，所述组织工程材料包括皮下填充剂、人工骨、人工皮肤、口腔可吸收生物膜、骨植入剂、骨修复支架。
[0013]第六方面，本专利技术提供一种骨修复支架的制备方法，包括以下步骤：
[0014]S1、将成骨因子BMP
‑
2加入到浓度为0.2mol/L的PBS溶液，然后将该溶液以20
‑
22μL：1mg的质量体积比滴在丝素蛋白微球粉末上，37℃下在摇床上混合3
‑
4小时，制得负载BMP
‑
2的微球溶液；PBS溶液中BMP
‑
2的浓度为0.1mol/L；
[0015]S2、按丝素蛋白微球粉末：纳米羟基磷灰石＝2：3的质量比，将纳米羟基磷灰石加入到所述负载BMP
‑
2的微球溶液中，然后冷冻干燥，首次冷冻干燥后用甲醇浸泡处理24
‑
25h，取出后再次冷冻干燥获得不溶于水的支架，将支架切片，制成与骨缺损形状相适配的形状，记作SF/nHAP支架切片；
[0016]S3、通过交联剂Sulfo
‑
Lc
‑
SPDP与SF/nHAP支架切片上的氨基发生反应，生成酰胺键，将交联剂固定到SF/nHAP支架切片上，再通过交联剂与I型重组胶原蛋白序列中的GFPGER上的巯基反应生成双硫键，从而将I型重组胶原蛋白固定到SF/nHAP支架切片，得所述骨修复支架。
[0017]进一步的，S2中，首次冷冻干燥和再次冷冻干燥的条件均为
‑
50℃，3
‑
4d。
[0018]第七方面，本专利技术提供所述方法制备得到的骨修复支架。
[0019]本专利技术具有如下有益效果：
[0020]专利技术人对通过来自天然人胶原蛋白的短氨基酸序列重复构建的重组胶原蛋白进行了技术文献调研，选取了现有技术中的来自天然人I型胶原蛋白的短氨基酸序列，然后将这些短氨基酸序列作为重复单元，构建不同重复次数的重组胶原蛋白，考察这些重组胶原蛋白在水溶液中长期保存的稳定性，以期获得能够在水溶液中长期稳定保存，且能够满足作为骨修复支架中的重要外源材料的重组胶原蛋白。专利技术人意外发现，通过将来自天然的人I型胶原蛋白的一段六肽(GFPGER)进行20～120次重复而得到的重组I型胶原蛋白具有异常优异的稳定性。具体体现在：
[0021](1)尽管其重复单元的长度是专利技术人测试的所有重组胶原蛋白中最短的，但其在水溶液中的稳定性是最好的；而通常认为，重复单元越短，氨基酸组成及分布就越单调，由此构建的重组胶原蛋白的表面电荷负载越大，越不容易达到稳定的平衡状态，因而更易水解。
[0022](2)其甚至比将该六肽进行60次或100次重复而得到的重组I型胶原蛋白更加稳定，而通常认为，重复次数越多，分子量越大，重组胶原蛋白的表面电荷负载越大，越不容易达到稳定的平衡状态，因而更易水解。
[0023]关于本专利技术的I型重组胶原蛋白具有异常优异的稳定性的原因，专利技术人正在进行更为深入的研究。初步的研究结果表明，这可能是因为：
[0024]以某一氨基酸序列作为重复片段进行重复的重组胶原，其稳定性与表面电荷密切相关，而表面电荷与氨基酸组成及蛋白的空间结构相关联，达到某一特定的重复次数后刚好形成了某一空间结构，使得表面荷载处于平衡或近平衡的状态，因此会表现出异常稳定的状态。专利技术人刚好找到了该6个氨基酸重复序列胶原蛋白处于荷载平衡的范围，因而本专利技术的I型重组胶原蛋白具有异常优异的稳定性。
附图说明
[0025]图1为No.2的I型重组胶原蛋白的SDS
‑
PAGE电泳图。
[0026]图2为No.2的I型重组胶原蛋白的二级结构分析图。
[0027]图3为No.2的I型重组胶原蛋白的疏水性分析图。
[0028]图4为不同处理组模型的Micro
‑
CT扫描重建和新生骨含量分析结果。
具体实施方式
[0029]下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明，但不应理解为本专利技术的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种稳定的I型重组胶原蛋白，其特征在于，由来自天然人I型胶原蛋白的短氨基酸序列作为重复单元进行多次重复而构成，其中，所述短氨基酸序列为GFPGER，重复次数为20～120次。2.编码权利要求1所述I型重组胶原蛋白的基因。3.含有权利要求2所述基因的重组工程菌。4.权利要求3所述重组工程菌的表达产物，其特征在于，所述表达产物为权利要求1所述I型重组胶原蛋白。5.权利要求1所述I型重组胶原蛋白或权利要求4所述表达产物在制备组织工程材料中的应用，其特征在于，所述组织工程材料包括皮下填充剂、人工骨、人工皮肤、口腔可吸收生物膜、骨植入剂、骨修复支架。6.权利要求1所述I型重组胶原蛋白联合成骨因子BMP
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2在制备骨修复支架中的应用。7.一种骨修复支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将成骨因子BMP
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2加入到浓度为0.2mol/L的PBS溶液，然后将该溶液以20
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22μL：1mg的质量体积比滴在丝素蛋白微球粉末上，37℃下在摇床上混合3
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4小时，制得负载BMP
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【专利技术属性】
技术研发人员：李伟娜，刘金轮，范代娣，宇文伟刚，朱晨辉，段志广，徐茹，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：
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