一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的Nrf2激动肽制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的Nrf2激动肽。Pro

【技术实现步骤摘要】
一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的Nrf2激动肽


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的Nrf2激动肽。

技术介绍

[0002]机体处于氧化应激状态可以释放大量ROS，诱使细胞内脂质发生过氧化反应、酶活性降低、蛋白质结构发生变化引起细胞和组织氧化损伤。Nrf2
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ARE信号通路是最重要的抗氧化通路之一，可以调控内源性抗氧化酶的表达。正常生理条件下，核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)与kelch样ECH关联蛋白1(Keap 1)在细胞质中结合并通过泛素化降解，维持Nrf2含量在生理需要水平；当机体受到氧化应激时，ROS可以导致Keap 1的半胱氨酸残基被修饰与Nrf2发生解离
[
，Nrf2通过去泛素化被释放出来进入细胞核，在核内与抗氧化反应元件(ARE)结合从而上调抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表达来清除过多的自由基，如血红素氧合酶
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1(HO
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1)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸：醌氧化还原酶1(NQO1)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH
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Px)等。研究发现，激活Nrf2
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ARE信号通路可促进细胞保护基因转录，减少氧化应激受到的损伤，起到肾脏保护作用。

技术实现思路

[0003]一方面，本专利技术提供了一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的Nrf2激动肽(PSRILYG)，Pro
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Ser
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Arg
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Ile
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Leu
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Tyr
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Gly，该寡肽有显著的抗氧化活性，能激活Nrf2通路从而保护细胞免受氧化损伤。
[0004]另一方面，本专利技术提供了一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的Nrf2激动肽(PSRILYG)，Pro
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Gly的制备方法，其包括以下步骤：
[0005]a)酶解：取龙头鱼骨胶原蛋白，加入蒸馏水中混合均匀，利用木瓜蛋白酶进行酶解，pH8.0、温度55℃，水解4h，酶解完成后水浴煮沸10min灭活，离心取上清液调节pH至中性；
[0006]b)过滤：将酶解液经过0.22μm滤膜过滤，再利用分子量为1kDa超滤膜过滤，将滤液冷冻干燥，得冻干粉；
[0007]c)Sephadex G
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15凝胶层析：将90mg的步骤b)中的冻干粉溶于3mL蒸馏水中，上SephadexG
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15凝胶柱进行分离，洗脱液为蒸馏水，洗脱液流速为0.3mL/min，每管收集时间为3min，每100管为一个循环，将试管中收集的洗脱液置于微量比色皿中，于280nm波长处测定紫外吸收值，合并吸光值最强的几管收集液，冷冻干燥，测定各峰DPPH
·
清除率，选取清除活性最高的成分进行后续分离；
[0008]d)全自动高压制备分离：将步骤c)中活性最高的组分配成1mg/mL的溶液，用0.22μm滤膜过滤，流动相为水和乙腈(含0.1％三氟乙酸)，乙腈的洗脱梯度为10％～95％，进样量为5mL，流速为3.0mL/min，洗脱时间为90min，检测波长设置为215和280nm；收集洗脱峰，冷冻干燥；通过LC
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MS/MS分析确定所得的寡肽序列为Pro
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Gly。
[0009]在一些实施方式中，所述步骤a)中所述龙头鱼骨胶原蛋白的制备包括以下步骤：将鱼骨剪碎，除去非胶原物质、脱钙处理、去脂肪处理及提取鱼胶原蛋白步骤。
[0010]在一些实施方式中，所述步骤a)中所述龙头鱼骨胶原蛋白的制备包括以下步骤：将处理好的鱼骨剪碎，按1:20(g/ml)的料液比用0.1mol/L NaOH溶液搅拌鱼骨48h，中间换液4次，用来除去非胶原物质，蒸馏水洗至中性；接着按1:20(g/ml)的料液比将鱼骨浸泡于浓度为0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐溶液中搅拌48h进行脱钙处理，中途换液4次，处理完后清洗数遍；然后按1:20(g/ml)的料液比用15％的异丙醇溶液搅拌鱼骨直至除去鱼骨中的脂肪，然后将异丙醇清洗干净，整个实验过程均在4℃下进行；按1:30(g/ml)料液比加入0.5mol/L乙酸溶液(含重量比0.5％的胃蛋白酶)在4℃搅拌一天提取鱼骨胶原蛋白，提取结束后用脱脂棉纱布过滤，按上述方法反复提取两次，合并滤液；向滤液中加入NaCl溶液进行盐析并不断搅拌至无沉淀洗出，将悬浊液在4℃、12000r/min的条件下离心，离心管底部的沉淀复溶于0.5mol/L乙酸溶液，最后装入透析袋透析至中性，冷冻干燥，制得鱼胶原蛋白。
[0011]在一些实施方式中，所述步骤a)中龙头鱼骨胶原蛋白与蒸馏水的重量体积比g/ml为8：500。
[0012]在一些实施方式中，所述步骤a)中木瓜蛋白酶的添加量为5500U/g。
[0013]在一些实施方式中，所述步骤c)中冻干粉与蒸馏水的重量体积比mg/ml为30:1。
[0014]本专利技术通过酶解龙头鱼骨胶原蛋白，再利用凝胶层析和液质联用等技术分离鉴定获得新型寡肽Pro
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Gly(PSRILYG)；该寡肽有显著的抗氧化活性，能激活Nrf2通路从而保护细胞免受氧化损伤。
附图说明
[0015]图1为实施例1中的寡肽PSRILYG的质谱图。
[0016]图2为实施例2中寡肽PSRILYG对高糖诱导的HepG2细胞CAT酶活性的影响。
[0017]图3为实施例3中寡肽PSRILYG对高糖诱导的HepG2细胞SOD酶活性的影响。
[0018]图4为实施例4中寡肽PSRILYG对高糖诱导的HepG2细胞Nrf2表达的影响。
具体实施方式
[0019]以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述，但是，它们并不构成对本专利技术范围的限制或限定。
[0020]本专利技术所使用的溶剂没有特别的限制，可采用商购的常规溶剂。
[0021]模型组：加入55mmol/L葡萄糖溶液，处理时间为48h。
[0022]寡肽组：加入55mmol/L葡萄糖溶液，再加入100mg/L寡肽溶液，处理时间为48h。
[0023]对照组：葡萄糖溶液和寡肽溶液均不加。
[0024]本专利技术龙头鱼骨胶原蛋白的制备：将处理好的鱼骨剪碎，按1:20(g/ml)的料液比用0.1mol/L NaOH溶液搅拌鱼骨48h，中间换液4次，用来除去非胶原物质，蒸馏水洗至中性；接着按1:20(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的Nrf2激动肽，其特征在于所述激动肽的序列为：Pro
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Ser
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Arg
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Ile
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Leu
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Tyr
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Gly，该激动肽有显著的抗氧化活性，能激活Nrf2通路从而保护细胞免受氧化损伤。2.一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的Nrf2激动肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：a)酶解：取龙头鱼骨胶原蛋白，加入蒸馏水中混合均匀，利用木瓜蛋白酶进行酶解，pH8.0、温度55℃，水解4h，酶解完成后水浴煮沸10min灭活，离心取上清液调节pH至中性；b)过滤：将酶解液经过0.22μm滤膜过滤，再利用分子量为1kDa超滤膜过滤，将滤液冷冻干燥，得冻干粉；c)Sephadex G
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15凝胶层析：将90mg的步骤b)中的冻干粉溶于3mL蒸馏水中，上Sephadex G
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15凝胶柱进行分离，洗脱液为蒸馏水，洗脱液流速为0.3mL/min，每管收集时间为3min，每100管为一个循环，将试管中收集的洗脱液置于微量比色皿中，于280nm波长处测定紫外吸收值，合并吸光值最强的几管收集液，冷冻干燥，测定各峰DPPH
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清除率，选取清除活性最高的成分进行后续分离；d)全自动高压制备分离：将步骤c)中活性最高的组分配成1mg/mL的溶液，用0.22μm滤膜过滤，流动相为水和乙腈(含0.1％三氟乙酸)，乙腈的洗脱梯度为10％～95％，进样量为5mL，流速为3.0mL/min，洗脱时间为90min，检测波长设置为215和280nm；收集洗脱峰，冷冻干燥；通过LC
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MS/MS分析确定所得的寡肽序列为Pro
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Ser
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Arg
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Ile

【专利技术属性】
技术研发人员：沈思珏，阮丹妮，徐芷源，金火喜，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：