一种龙头鱼骨胶原蛋白的降血糖寡肽制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种龙头鱼骨胶原蛋白的降血糖寡肽Leu

【技术实现步骤摘要】
一种龙头鱼骨胶原蛋白的降血糖寡肽


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种龙头鱼骨胶原蛋白的降血糖寡肽。

技术介绍

[0002]糖尿病是以高血糖为特征的慢性代谢疾病，长期存在的高血糖可导致眼、肾、心血管、肝脏、神经等组织器官的损害和功能障碍，是人类健康的隐形杀手。随着糖尿病患者数量的逐渐增多，其正朝着不可控的局面发展。根据国际糖尿病联盟(IDF)糖尿病地图集第十版报道，截止到2021年，全世界有超过5.37亿人患有糖尿病，分布于各个年龄阶层，预计到2030年患病人数将增加到6.43亿，全世界每5秒就有一人死于糖尿病。全球糖尿病患病率持续上升，昂贵的治疗费也给各国带来了巨大的经济负担，世界各国人民的健康和福祉此时面临着严峻的挑战。在高血糖刺激下产生过多的ROS而导致的氧化应激是引起肝脏疾病的重要因素，肝脏损伤会造成机体糖脂代谢紊乱程度加剧，血糖进一步增高，致使糖原累积异常诱发肝脏微血管病变，与糖尿病的发展有着密不可分的关系。

技术实现思路

[0003]一方面，本专利技术提供了一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的降血糖寡肽Leu
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Ala
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Leu
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Phe
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Val
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Pro
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Arg(LALFVPR)，该寡肽有显著的降血糖活性，能显著降低糖尿病小鼠的血糖及修复小鼠糖代谢功能。
[0004]另一方面，本专利技术提供了一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的降血糖寡肽Leu
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Ala
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Leu
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Phe
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Val
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Pro
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Arg(LALFVPR)的制备方法，其包括以下步骤：
[0005]a)酶解：取处理好的龙头鱼骨胶原蛋白，加入蒸馏水混合均匀，利用木瓜蛋白酶进行酶解，pH8.0、温度55℃，酶解完成后水浴煮沸10min灭活，离心取上清液调节pH至中性；
[0006]b)过滤：将酶解液经过0.22μm滤膜过滤，再利用分子量为1kDa超滤膜过滤，将滤液冷冻干燥，得冻干粉；
[0007]c)Sephadex G
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15凝胶层析：将步骤b)中的冻干粉溶于蒸馏水中，上Sephadex G
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15凝胶柱进行分离；洗脱液为蒸馏水，洗脱液流速为0.3mL/min，每管收集时间为3min，每100管为一个循环；将试管中收集的洗脱液置于微量比色皿中，于280nm波长处测定紫外吸收值，合并吸光值最强的几管收集液，冷冻干燥，测定各峰DPPH
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清除率，选取清除活性最高的成分进行后续分离；
[0008]d)全自动高压制备分离：将步骤c)中活性最高的组分配成1mg/mL的溶液，用0.22μm滤膜过滤，流动相为水和乙腈(含0.1％三氟乙酸)，乙腈的洗脱梯度为10％～95％，进样量为5mL，流速为3.0mL/min，洗脱时间为90min，检测波长设置为215和280nm，收集洗脱峰，冷冻干燥，通过LC
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MS/MS分析确定所得的寡肽序列为Leu
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Ala
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Leu
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Val
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Pro
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Arg(LALFVPR)。
[0009]在一些实施方式中，所述步骤a)中所述龙头鱼骨胶原蛋白的制备包括以下步骤：将鱼骨剪碎，除去非胶原物质、脱钙处理、去脂肪处理及提取鱼胶原蛋白步骤。
[0010]在一些实施方式中，所述步骤a)中所述龙头鱼骨胶原蛋白的制备包括以下步骤：将处理好的鱼骨剪碎，按1:20(g/ml)的料液比用0.1mol/L NaOH溶液搅拌鱼骨48h，中间换液4次，用来除去非胶原物质，蒸馏水洗至中性；接着按1:20(g/ml)的料液比将鱼骨浸泡于浓度为0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐溶液中搅拌48h进行脱钙处理，中途换液4次，处理完后清洗数遍；然后按1:20(g/ml)的料液比用15％的异丙醇溶液搅拌鱼骨直至除去鱼骨中的脂肪，然后将异丙醇清洗干净，整个实验过程均在4℃下进行；按1:30(g/ml)料液比加入0.5mol/L乙酸溶液(含重量比0.5％的胃蛋白酶)在4℃搅拌一天提取鱼骨胶原蛋白，提取结束后用脱脂棉纱布过滤，按上述方法反复提取两次，合并滤液；向滤液中加入NaCl溶液进行盐析并不断搅拌至无沉淀洗出，将悬浊液在4℃、12000r/min的条件下离心，离心管底部的沉淀复溶于0.5mol/L乙酸溶液，最后装入透析袋透析至中性，冷冻干燥，制得鱼胶原蛋白。
[0011]在一些实施方案中，所述步骤a)中龙头鱼骨胶原蛋白与蒸馏水的重量体积比g/ml为8:500。
[0012]在一些实施方案中，所述步骤a)中木瓜蛋白酶的添加量为5500U/g。
[0013]在一些实施方式中，所述步骤c)中冻干粉与蒸馏水的重量体积比mg/ml为30:1。
[0014]本专利技术通过酶解龙头鱼骨胶原蛋白，再利用凝胶层析和液质联用等技术分离鉴定获得新型寡肽Leu
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Arg(LALFVPR)；该寡肽有显著的降血糖活性，能显著降低糖尿病小鼠的血糖及修复小鼠糖代谢功能。
附图说明
[0015]图1为实施例1中寡肽LALFVPR质谱图。
[0016]图2为实施例2中寡肽LALFVPR对小鼠血糖浓度的影响图。
[0017]图3为实施例3中寡肽LALFVPR对糖尿病小鼠血清胰岛素浓度的影响图。
[0018]图4为实施例4中寡肽LALFVPR对糖尿病小鼠肝糖原浓度的影响图。
[0019]图5为实施例5中寡肽LALFVPR对糖尿病小鼠肌糖原浓度的影响图。
具体实施方式
[0020]以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述，但是，它们并不构成对本专利技术范围的限制或限定。
[0021]本专利技术所使用的溶剂没有特别的限制，可采用商购的常规溶剂。
[0022]本专利技术龙头鱼骨胶原蛋白的制备：将处理好的鱼骨剪碎，按1:20(g/ml)的料液比用0.1mol/L NaOH溶液搅拌鱼骨48h，中间换液4次，用来除去非胶原物质，蒸馏水洗至中性；接着按1:20(g/ml)的料液比将鱼骨浸泡于浓度为0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐溶液中搅拌48h进行脱钙处理，中途换液4次，处理完后清洗数遍；然后按1:20(g/ml)的料液比用15％的异丙醇溶液搅拌鱼骨直至除去鱼骨中的脂肪，然后将异丙醇清洗干净，整个实验过程均在4℃下进行；按1:30(g/ml)料液比加入0.5mol/L乙酸溶液(含重量比0.5％的胃蛋白酶)在4℃搅拌一天提取鱼骨胶原蛋白，提取结束后用脱脂棉纱布过滤，按上述方法反复提取两次，合并滤液；向滤液中加入NaCl溶液进行盐析并不断搅拌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的降血糖寡肽，其特征在于所述寡肽的序列为Leu
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Ala
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Leu
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Arg，该寡肽有显著的降血糖活性，能显著降低糖尿病小鼠的血糖及修复小鼠糖代谢功能。2.一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的降血糖寡肽Leu
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Arg的制备方法，其特征在于包括以下步骤：a)酶解：取处理好的龙头鱼骨胶原蛋白，加入蒸馏水混合均匀，利用木瓜蛋白酶进行酶解，pH8.0、温度55℃，酶解完成后水浴煮沸10min灭活，离心取上清液调节pH至中性；b)过滤：将酶解液经过0.22μm滤膜过滤，再利用分子量为1kDa超滤膜过滤，将滤液冷冻干燥，得冻干粉；c)Sephadex G
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15凝胶层析：将步骤b)中的冻干粉溶于蒸馏水中，上Sephadex G
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15凝胶柱进行分离；洗脱液为蒸馏水，洗脱液流速为0.3mL/min，每管收集时间为3min，每100管为一个循环；将试管中收集的洗脱液置于微量比色皿中，于280nm波长处测定紫外吸收值，合并吸光值最强的几管收集液，冷冻干燥，测定各峰DPPH
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清除率，选取清除活性最高的成分进行后续分离；d)全自动高压制备分离：将步骤c)中活性最高的组分配成1mg/mL的溶液，用0.22μm滤膜过滤，流动相为水和乙腈(含0.1％三氟乙酸)，乙腈的洗脱梯度为10％～95％，进样量为5mL，流速为3.0mL/min，洗脱时间为90min，检测波长设置为215和280nm，收集洗脱峰，冷冻干燥，通过LC
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MS/MS分析确定所得的寡肽序列为Leu
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Arg。3.根据权利要求2所述一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的降血糖寡肽Leu
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Arg的制备方法，其特征在于所述步骤a)中所述龙头鱼骨胶原蛋白的制备包括以下步骤：将...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶思怡，江露雅，杨少茹，金火喜，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：