玉米霜霉病菌实时荧光PCR检测引物组、试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种玉米霜霉病菌实时荧光PCR检测引物组、试剂盒及其检测方法。引物组包括SEQ ID NO.1～3所示序列，试剂盒包括所述引物组、反应液A、空白对照、阳性对照。本发明专利技术的优点包括：应用在检测玉米霜霉病菌中，具有较高的特异性和灵敏度、检测结果准确可靠。检测结果准确可靠。检测结果准确可靠。

【技术实现步骤摘要】
玉米霜霉病菌实时荧光PCR检测引物组、试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术涉及植物检疫
，尤其涉及玉米病害的检测技术。

技术介绍

[0002]玉米霜霉病(Maize Downy mildew)是热带、亚热带地区的重要病害。由于霜霉病造成的玉米产量损失可达30％～60％，1986年，我国将此病定为进口植物检疫对象。
[0003]玉米霜霉病的病原菌有3个属9个种，分别是：霜霉属中的玉蜀黍指霜霉，菲律宾指霜霉，甘蔗指霜霉，蜀黍指霜霉，异穗指霜霉，白发指霜霉；指梗霜霉属中的禾生指梗霜霉；指疫霉属中的大孢指疫霉，褐条指疫霉。玉米霜霉病在玉米幼苗期和成株期都可发生，病菌主要侵染叶片，也为害叶鞘和苞叶。幼苗期发病，全株淡绿色至黄白色，后逐渐枯死。成株期发病，多由中部叶片基部开始，逐渐向上蔓延。发病初期为淡绿色条纹，后即互相连合，叶片的下半部或全部变为淡绿色至黄白色，以致枯死。在潮湿的环境下，病叶的正背两面均长白色霉状物，这是病菌的孢囊梗和孢子囊。重病植株不结苞，轻病植株能抽穗结苞，但籽粒不饱满，产量低。由于霜霉病严重影响玉米生产，世界各国对该病的研究都比较重视。
[0004]目前玉米霜霉病菌的检测方法为PCR法、镜检、洗涤检测、种植检测等，如今，实时荧光定量PCR技术以其高灵敏度、高特异性、高检测效率等优点，成为分子检测的重要检测方法。基于该方法，能够实现对玉米霜霉病菌进行快速、准确检测，满足我国国内以及进出口的植物检疫的需要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供玉米霜霉病菌实时荧光PCR检测引物组、试剂盒及其检测方法，以解决现有技术中的缺乏针对玉米霜霉病菌的高效准确检测技术的问题。
[0006]为了达到上述目的本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种玉米霜霉病菌实时荧光PCR检测引物组，包括：正向引物Genus
‑
F，其序列如SEQ ID NO.1所示；反向引物Genus
‑
R，其序列如SEQ ID NO.2所示；探针Genus
‑
P，其序列如SEQ ID NO.3所示，所述探针5
’
端修饰有荧光基团，3
’
端修饰有淬灭基团。
[0008]进一步地，所述探针5
’
端修饰有FAM荧光基团，3
’
端修饰有BHQ1淬灭基团。
[0009]本专利技术还提供一种包含所述的玉米霜霉病菌实时荧光PCR检测引物组的试剂盒。
[0010]进一步地，试剂盒还包括反应液A、空白对照、阳性对照。
[0011]进一步地，所述反应液A包括2
×
PCRbuffer、Taq DNA聚合酶、UDG酶；
[0012]所述空白对照是超纯水；
[0013]所述阳性对照是含有靶标序列的重组质粒，所述阳性对照的重组质粒浓度为10
‑
100pg/μL。
[0014]进一步地，所述重组质粒是由靶标序列插入含有Ampicillin抗性的载体上制得，靶标序列如SEQ ID NO.4所示。
[0015]一种应用所述的包含玉米霜霉病菌实时荧光PCR检测引物组的试剂盒的反应体
系，反应体系总体积为25μL，包括1
×
PCRBuffer、0.04～0.06U/μLTaq DNA聚合酶、0.01～0.04U/μL UDG酶、正向引物Genus
‑
F 0.4μM、反向引物Genus
‑
R0.4μM、探针Genus
‑
P 0.2μM、待测样品DNA 5μL、余量超纯水。
[0016]进一步地，所述1
×
PCR Buffer的成分包括45～55mmol/LKCl、8～12mmol/LTris
‑
HCl、1.4～1.6mmol/L MgCl2、90～110μg/mL牛血清白蛋白(BSA)、dNTP各190～210μmol/L。
[0017]进一步地，反应程序：去污染，37℃，10分钟，1个循环；预变性，95℃，5分钟，1个循环；扩增，95℃，15秒，60℃，1分钟，40个循环；荧光采集。荧光采集判定结果：PCR反应结束后根据扩增曲线及Ct值判定结果，若待测样品产生典型的扩增曲线，且Ct值小于35，说明待测样品为玉米霜霉病菌，反之，则不是玉米霜霉病菌。
[0018]本专利技术还提供一种所述的玉米霜霉病菌实时荧光PCR检测引物组在制备检测玉米霜霉病菌试剂中的应用。
[0019]本专利技术的优点在于：特异性强；灵敏度可达101copies/μL(0.1fg/μL)；检测效率高；结果准确可靠，稳定性好。
附图说明
[0020]此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本专利技术的不当限定，在附图中：
[0021]图1是检测玉米霜霉病菌核酸反应体系灵敏度统计图；
[0022]图2是检测玉米霜霉病菌核酸反应体系特异性统计图；
[0023]图3是检测玉米霜霉病菌核酸反应体系重复性统计图。
具体实施方式
[0024]下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本专利技术，在此以本专利技术的示意性实施例及说明用来解释本专利技术，但并不作为对本专利技术的限定。
[0025]实施例一
[0026]基于玉米霜霉病菌的OK350684.1序列设计正向引物Genus
‑
F、反向引物Genus
‑
R、探针Genus
‑
P，正向引物Genus
‑
F的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物Genus
‑
R的序列如SEQ ID NO.2所示，探针Genus
‑
P的序列如SEQ ID NO.3所示，玉米霜霉病菌的OK350684.1序列如SEQ ID NO.4所示：
[0027]SEQ ID NO.1：AGGAGTCTAACATGTGTGCAAGTGTT；
[0028]SEQ ID NO.2：GACAGCTTGCGCTGACCTTTA；
[0029]SEQ ID NO.3：CGAAACCCCAGCGCGAAATGAA，5
’
端修饰有FAM荧光基团，3
’
端设计有BHQ1淬灭基团；
[0030]SEQ ID NO.4：
[0031]AGGAGTCTAACATGTGTGCAAGTGTTAGGGTGTCGAAACCCCAGCGCGAA ATGAAAGTAAAGGTCAGCGCAAGCTGTC。
[0032]以含靶标序列的重组质粒为模板配制PCR反应体系，PCR反应体系共25μL，其配制按照表1进行：
[0033]表1PCR反应体系配制表
[0034][0035]PCR反应的程序按照表2进行：
[0036]表2PCR反应程序
[0037][0038本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种玉米霜霉病菌实时荧光PCR检测引物组，其特征在于：包括：正向引物Genus
‑
F，其序列如SEQ ID NO.1所示；反向引物Genus
‑
R，其序列如SEQ ID NO.2所示；探针Genus
‑
P，其序列如SEQ ID NO.3所示，所述探针5
’
端修饰有荧光基团，3
’
端修饰有淬灭基团。2.根据权利要求1所述的一种玉米霜霉病菌实时荧光PCR检测引物组，其特征在于：所述探针5
’
端修饰有FAM荧光基团，3
’
端修饰有BHQ1淬灭基团。3.一种包含如权利要求1或2所述的玉米霜霉病菌实时荧光PCR检测引物组的试剂盒。4.根据权利要求3所述的一种包含玉米霜霉病菌实时荧光PCR检测引物组的试剂盒，其特征在于：还包括反应液A、空白对照、阳性对照。5.根据权利要求4所述的一种包含玉米霜霉病菌实时荧光PCR检测引物组的试剂盒，其特征在于：所述反应液A包括2
×
PCRbuffer、Taq DNA聚合酶、UDG酶；所述空白对照是超纯水；所述阳性对照是含有靶标序列的重组质粒，所述阳性对照的重组质粒浓度为10
‑
100pg/μL。6.根据权利要求5所述的一种包含玉米霜霉病菌实时荧光PCR检测引物组的试剂盒，其特征在于：所述重...

【专利技术属性】
技术研发人员：张璜，郭秋霞，陈业星，余嘉明，高金艳，林雪金，林梦蝶，黄振兴，
申请(专利权)人：广东双螺旋基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：