大白菜亮绿基因BrWAX3的InDel标记、引物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及InDel标记的检测引物及其在亮绿无蜡粉大白菜育种中的应用，属于分子遗传育种领域。本发明专利技术通过BSA

【技术实现步骤摘要】
大白菜亮绿基因BrWAX3的InDel标记、引物及其应用


[0001]本专利技术属于作物分子标记辅助育种
，具体涉及大白菜亮绿基因BrWAX3的InDel标记、引物及其应用。

技术介绍

[0002]植物表面的蜡质也称蜡粉，是覆盖在植物表皮细胞外的一层由亲脂性化合物构成的疏水层。蜡粉的主要作用是减少非气孔的水分散失、增强植株对生物胁迫和非生物胁迫的抗性等。此外，蜡质还影响植物的生长发育，蜡质缺失相关基因的突变会引起器官融合和育性降低。
[0003]白菜类作物(Brassica rapa L.)属于十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)，包括大白菜(B.rapa.pekinensis)、小白菜(B.rapa.chinensis)、芜菁(B.rapa.rapifera)、菜心(B.rapa.L.chinensis var.utilis Tsen et Lee)等多个亚种和变种，拥有共同的基因组(A基因组)，相互之间杂交可以结实，没有生殖隔离，在大白菜中鉴定的优异基因可以通过杂交并回交的方式转移到菜心和小白菜中。白菜类作物中的菜心和薹菜等以鲜嫩的茎和叶为食用器官，其叶片和茎表皮蜡质性状是一个重要商品性状。蜡质缺失蔬菜的叶片和茎部表皮覆盖蜡质极少，颜色亮绿，有光泽，商品性好，食用品质佳，感官上更鲜嫩，更受消费者喜爱。但是白菜类蔬菜的蜡质性状只有在抽薹开花期才能表现出来，在选育亮绿无蜡粉材料过程中费时费力，极大的延缓了育种进程。因此为了加快亮绿无蜡粉品种的育种速度，利用现代的分子生物学技术，进行分子标记辅助育种十分必要。
[0004]竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive allele specific PCR，KASP)，基于引物末端碱基的特异性匹配对SNP或者InDel进行基因分型，包含2条正向引物和1条反向引物，两条正向引物5
’
端分别携带有不同序列的荧光接头序列FAM或HEX，因此，根据荧光信号的不同就可检测SNP或者InDel的特异性。具有准确性高、低成本、高通量等优点，是目前国际上对SNP和InDel进行基因分型分析的主流方法之一。目前，KASP
‑
SNP分型技术已广泛应用于植物的遗传图谱构建、基因定位、种质资源分析、分子标记辅助育种、种子纯度鉴定等方面(Allen et al.，2011；Wu et al.，2018；Shi et al.，2015)。

技术实现思路

[0005]本专利技术在大白菜中挖掘到一个新的亮绿无蜡粉基因，并针对此基因开发了紧密连锁的KASP标记，为利用该标记进行亮绿无蜡粉品种分子辅助育种，加快育种进程奠定了基础。
[0006]本专利技术提供了一种大白菜亮绿无蜡粉基因BrWAX3的InDel标记，所述InDel标记如SEQID NO：1所示。
[0007]本专利技术提供了一种大白菜亮绿无蜡粉基因BrWAX3的InDel标记的KASP检测引物，所示检测引物包含有：纯合有蜡粉性状的特异引物如SEQID NO：2所示；纯合亮绿无蜡粉性状的特异引物如SEQID NO：3所示；反向引物如SEQID NO：4所示。
[0008]所述引物在白菜类蔬菜选育中的应用。
[0009]所述选育指对纯合亮绿无蜡粉性状的选育
[0010]所述应用包括将所述检测引物用于制备检测试剂盒。
[0011]选育出的纯合亮绿无蜡粉性状作为亲本育种。
[0012]一种大白菜亮绿无蜡粉品种选育方法，包含有如下步骤：
[0013](1)提取待测大白菜的基因组，获得基因组溶液；
[0014](2)对上步得到的基因组溶液进行KASP
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PCR扩增；
[0015](3)KASP
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PCR扩增产物用罗氏荧光定量PCR仪LightCycler 480Instrument II(LC480II)进行终点法荧光信号读取。利用LC480 software v1.5.1分析SNP分型结果：纯合有蜡粉材料的信号点为蓝色，5'末端连接FAM荧光标签序列的引物竞争性扩增，聚合在X轴附近；纯合亮绿无蜡粉材料的信号点为绿色，5'末端连接HEX荧光标签序列的引物竞争性扩增，聚合在Y轴附近；杂合蜡粉材料的信号点为红色，聚合在对角线附近。
[0016]本专利技术挖掘了白菜类蔬菜新的亮绿无蜡粉基因BrWAX3，专利技术了亮绿无蜡粉基因BrWAX3的InDel标记A09
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24305871，公布了检测该标记的检测引物BrWAX3
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KASP1。该InDel标记及其检测引物能够准确、高效地检测亮绿及有蜡粉基因型。此筛选方法不受环境因素影响，能大幅度降低田间选择工作量，有助于辅助加快大白菜育种。
附图说明
[0017]图1亮绿无蜡粉基因BrWAX3的BSA
‑
Seq定位结果；注：绘图窗口为1Mb，步移长度50kb，黄线为95％置信区间，蓝线为99％置信区间。定位区间是A09染色体上的候选区域(19.65
‑
26.15Mb)；
[0018]图2BrWAX3的克隆及序列差异；
[0019]图3利用标记BrWAX3
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KASP1对BC1P1群体进行KASP基因分型；
[0020]图4利用标记BrWAX3
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KASP1对(SD369
×
SD2135)
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F2群体进行KASP基因分型。
具体实施方式
[0021]1、供试材料和抗病性状调查
[0022]选择大白菜亮绿无蜡粉DH系材料SD369(P1)(Yang et al，Map
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Based Cloning and Characterization of Br
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dyp1,a Gene Conferring Dark Yellow Petal Color Trait in Chinese Cabbage(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)，Frontiers in Plant Science,13:841328)和有蜡粉材料R16
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11(P2)(杨双娟等，2020，大白菜抽薹相关基因BrFLC1的KASP标记开发，核农学报，34(2):0265
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0272)作为亲本，对两个材料进行杂交获得F1代种子，F1材料自交获得F2代种子，F1分别与SD369(P1)和R16
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11(P2)杂交获得BC1P1和BC1P2种子。将所有材料种植于河南农业科学院园艺研究所原阳实验田，田间统一管理，待所有材料抽薹后调查每个植株花茎、叶片上有无蜡粉。
[0023]大白菜蜡粉性状遗传规律：通过对P1、P2、F1、F2、BC1P1和BC1P2六个世代的蜡粉性状调查发现，10株F1植株的叶片、花茎和花蕾等器官表明均有蜡粉，F2群体中有蜡粉植株102株，无蜡粉植株4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大白菜亮绿无蜡粉基因BrWAX3的InDel标记，其特征在于：所述InDel标记如SEQ ID NO：1所示。2.一种大白菜亮绿无蜡粉基因BrWAX3的InDel标记的KASP检测引物，其特征在于，所示检测引物包含有：纯合有蜡粉性状的特异引物如SEQ ID NO：2所示；纯合亮绿无蜡粉性状的特异引物如SEQ ID NO：3所示；反向引物如SEQ ID NO：4所示。3.如权利要求2所述的引物在白菜类蔬菜选育中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述选育指对纯合亮绿无蜡粉性状的选育。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用包括将所述检测引物用于制备检测试剂盒。6.如权利要求4所述应用，其特征在于，选育出的纯合亮绿无蜡粉性状作为亲本育种。7.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓伟，杨双娟，原玉香，苏贺楠，王志勇，魏小春，赵艳艳，白凯红，李林，牛刘静，
申请(专利权)人：河南省农业科学院园艺研究所，
类型：发明
国别省市：