一种适用于铅锌-抗生素-抗性基因污染土壤修复的复合微生物菌剂的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种适用于铅锌

【技术实现步骤摘要】
一种适用于铅锌
‑
抗生素
‑
抗性基因污染土壤修复的复合微生物菌剂的制备方法


[0001]本专利技术属于污染土壤的微生物修复剂开发领域，具体涉及一种适用于铅锌
‑
抗生素
‑
抗性基因污染土壤修复的复合微生物菌剂的制备方法。

技术介绍

[0002]土壤是自然环境的重要组成部分，是植物生长的基础，也是农业生产的基础。在农业生产的过程中，由于抗生素的误用和滥用，使得大量的抗生素以原药或代谢物的形式随人或动物体的排泄而进入环境，进而增加了土壤或水环境中微生物的抗性压力，加速了大量抗性微生物的产生，抗性基因一旦产生后不会迅速消失，土壤中铅、锌等重金属与抗性基因的分布存在一定的相关性，影响着抗性基因丰度，形成铅锌
‑
抗生素
‑
抗性基因污染土壤，污染物进入土壤环境后会对土壤生态系统造成深刻影响，进而危害农作物绿色可持续发展。处理土壤中抗生素污染的途径很多，传统物理化学方法对治理严重污染土壤具有时间短、见效快的效果，例如微波处理、高温分解、光催化和土壤异位堆肥，但这些技术耗能高、费用高、易引起二次污染，并且对于处理大面积的农田和低水平的抗生素污染土壤并不适用。微生物修复是利用特定微生物体对土壤中重金属离子的螯合作用，以及对土壤中游离抗性基因的固定作用，促进土壤生态平衡的绿色生物防控措施。具有高效经济、环境友好等特点。该技术已广泛应用于各种污染土壤修复领域，具有较高的应用价值。

技术实现思路

[0003]专利技术目的：本专利技术的目的是提供一种适用于铅锌
‑
抗生素
‑
抗性基因污染土壤修复的复合微生物菌剂及其制备方法，利用微生物修复的方式实现铅锌
‑
抗生素
‑
抗性基因污染土壤的有效修复。
[0004]本专利技术一种适用于铅锌
‑
抗生素
‑
抗性基因污染土壤修复的复合微生物菌剂，其中所述菌种黄色微球菌Micrococcus flavus PS5于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9929；苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9934；不解糖假苍白杆菌Pseudochrobactrum asaccharolyticum ZS2于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9930。
[0005]技术方案：
[0006]为了实现本专利技术的上述目的，采用以下技术方案：
[0007](1)制备一种适用于铅锌
‑
抗生素
‑
抗性基因污染土壤修复的复合微生物菌剂包括以下步骤：
[0008]步骤一：种子发酵液制备：
[0009]调节液体种于发酵培养基A的pH至6.5
‑
6.8，并进行常规灭菌处理，按照无菌操作
方法分别挑取生长于斜面培养基的活化菌株，包括抗锌细菌ZS2解糖假苍白杆菌CGMCC No.9930、抗铅锌细菌PS45苏云金芽孢杆菌CGMCC No.9934、抗铅细菌PS5黄色微球菌CGMCC No.9929，接入液体种子发酵培养基A进行摇瓶发酵，恒定温度32
±
1℃，摇床转速200
‑
220rpm，待菌株发酵达到对数期时停止发酵。
[0010]步骤二：复合发酵：
[0011]调节液体复合菌发酵培养基B的pH至6.5
‑
6.8，并进行常规灭菌处理，按液体质量6
‑
9％无菌操作接入步骤一获得的复合菌种子发酵液。复合菌中解糖假苍白杆菌ZS2、苏云金芽孢杆菌PS45、黄色微球菌PS5均处于对数期，其比例为1：(1.5
‑
2)：1，恒定温度35
±
1℃，搅拌速度200
‑
250rpm，通风量0.25
‑
0.28M3/min，罐压0.07
‑
0.08MPa，持续发酵68
‑
72hr，显微镜检测发酵液中细菌数目达到9.0
×
10
11
个/mL时终止发酵；
[0012]步骤三：活菌细胞收集：
[0013]分别收集步骤二复合液体复合菌发酵培养基B的发酵液，用酵母分离离心机离心分离除去发酵液中的水，获得浅黄色粘稠状菌体细胞；
[0014]步骤四：复合微生物制剂制取；
[0015]在步骤三获得的浅黄色粘稠状菌体细胞中，按照菌体与甘油的体积比1：(0.5
‑
0.8)的比例加入甘油，并搅拌混合均匀。再按照体积比1：(1.2
‑
1.5)的比例加入细度为300目的硅藻土，搅拌混合均匀，获得浅黄色固体制剂即目的复合微生物制剂产品。
[0016]步骤一中，液体发酵培养基A的配方如下：
[0017]甘油15
‑
20g/L，NaNO32.0
‑
2.5g/L，(NH4)2SO42.0
‑
2.5g/L，MgSO4·
7H2O0.5
‑
0.8g/L，K2HPO41.5
‑
2.0g/L，KH2PO41.5
‑
2.0g/L，NaCl1.0
‑
1.5g/L，CaCl2·
2H2O0.01
‑
0.03g/L，FeSO4·
7H2O0.01
‑
0.03g/L，酵母提取物1
‑
1.5g/L，漆黄素0.2
‑
0.4g/L，余量水定容至1L。
[0018]步骤二中，液体发酵培养基B的配方如下：
[0019]葡萄糖5
‑
8g/L，玉米浆8
‑
10g/L，NaNO32.0
‑
2.5g/L，(NH4)2SO
43‑
5g/L，K2HPO41.0
‑
1.5g/L，MnSO4·
2H2O0.3
‑
0.5mg/L，Na2HPO40.3
‑
0.5g，CaCl2·
2H2O0.01
‑
0.03g/L，酵母粉0.01
‑
0.03g/L，漆黄素0.5
‑
1.0g/L，余量水定容至1L。
[0020](2)复合微生物菌剂修复铅锌
‑
抗生素
‑
抗性基因污染土壤的应用
[0021]一种适用于铅锌
‑
抗生素
‑
抗性基因污染土壤修复的复合微生物菌剂的制备方法及应用，其特征在于，采用权利要求1...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于铅锌
‑
抗生素
‑
抗性基因污染土壤修复的复合微生物菌剂及其制备方法，其特征在于，包括抗锌细菌解糖假苍白杆菌、抗铅锌细菌苏云金芽孢杆菌、抗铅细菌黄色微球菌、硅藻土。2.根据权利要求1所述的一种适用于铅锌
‑
抗生素
‑
抗性基因污染土壤修复的复合微生物菌剂，其特征在于：黄色微球菌Micrococcus flavus PS5于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9929；苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9934；不解糖假苍白杆菌Pseudochrobactrum asaccharolyticum ZS2于2014年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9930。3.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂其中抗锌细菌ZS2解糖假苍白杆菌CGMCC No.9930、抗铅锌细菌PS45苏云金芽孢杆菌CGMCC No.9934、抗铅细菌PS5黄色微球菌CGMCC No.9929经液体发酵制得，包括以下步骤：步骤一：种子发酵液制备：调节液体种子发酵培养基A的pH至6.5
‑
6.8，并进行常规灭菌处理，按照无菌操作方法分别挑取生长于斜面培养基的活化菌株，包括抗锌细菌ZS2解糖假苍白杆菌CGMCC No.9930、抗铅锌细菌PS45苏云金芽孢杆菌CGMCC No.9934、抗铅细菌PS5黄色微球菌CGMCC No.9929，接入液体种子发酵培养基A进行摇瓶发酵，恒定温度32
±
1℃，摇床转速200
‑
220rpm，待菌株发酵达到对数期时停止发酵；步骤二：复合发酵：调节液体复合菌发酵培养基B的pH至6.5
‑
6.8，并进行常规灭菌处理，按液体质量6
‑
9％无菌操作接入步骤一获得的复合菌种子发酵液。复合菌中解糖假苍白杆菌ZS2、苏云金芽孢杆菌PS45、黄色微球菌PS5均处于对数期，其比例为1:(1.5
‑
2):1，恒定温度35
±
1℃，搅拌速度200
‑
250rpm，通风量0.25
‑
0.28M3/min，罐压0.07
‑
0.08MPa，持续发酵68
‑
72hr，显微镜检测发酵液中细菌数目达到9.0
×
10
11
个/mL时终止发酵；步骤三：活菌细胞收集：分别收集步骤二复合液体复合菌发酵培养基B的发酵液，用酵母分离离心机离心分离除去发酵液中的水，获得浅黄色粘稠状菌体细胞；步骤四：复合微生物制剂制备：在步骤三获得的浅黄色粘稠状菌体细胞中，按照...

【专利技术属性】
技术研发人员：门欣，瞿佳，孙晓宇，赵玲侠，陈锐，
申请(专利权)人：陕西省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：