水稻OsNPR1基因及其在抗水稻黑条矮缩病毒中的应用制造技术

本发明专利技术涉及转基因技术领域及植物病毒病害防治领域，尤其涉及水稻水杨酸途径重要调控因子OsNPR1基因在植物抗水稻黑条矮缩病毒中的应用。的应用。的应用。

【技术实现步骤摘要】
水稻OsNPR1基因及其在抗水稻黑条矮缩病毒中的应用


[0001]本专利技术涉及转基因
及植物病毒病害防治领域，尤其涉及水稻水杨酸途径重要调控因子OsNPR1基因在植物抗水稻黑条矮缩病毒中的应用。

技术介绍

[0002]水稻黑条矮缩病毒(Rice black
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streaked dwarf virus,RBSDV，以下简称RBSDV)隶属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)。RBSDV是以昆虫灰飞虱为传播介体侵染植物，侵染植物寄主后可以引起植物畸形生长，主要症状表现为植株矮化、分蘖增加叶色深绿以及叶背和茎秆上出现白色瘤状突起等。该病毒在我国长江以南地区主要危害水稻引起水稻黑条矮缩病，在长江以北地区危害玉米引起玉米粗缩病。目前，国内外科学家已对RBSDV基因组序列、病毒蛋白功能以及部分病毒与植物寄主因子互作等方面做了大量的工作。例如：研究表明：RBSDV P5
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1，P6,P9是病毒复制工厂毒质的重要组成部分。P7
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2与S
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phase kinase
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associated protein 1(OsSKP1)相互作用形成SCF复合物。P8蛋白编码病毒的内层衣壳蛋白，具有抑制转录活性的功能。P10编码外壳蛋白，能够激活内质网应激反应。近年来随着气候变暖和耕作制度的改变，传播RBSDV的介体昆虫灰飞虱的虫口数量大幅增加，导致水稻黑条矮缩病爆发流行，严重危害我国粮食作物的安全生产。因此，培育水稻转基因抗性材料，能够为作物抗病育种提供重要的理论和技术指导，也为今后挖掘、创制优良的抗性种质资源，为从源头控制水稻黑条矮缩病的危害奠定基础。
[0003]水杨酸(Salicylic acid，SA)作为一种重要的植物抗性激素，在寄主抵抗病原物侵染过程中发挥着重要的作用。SA能够诱导包括病原相关蛋白(pathogenesis
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related protein，PR蛋白)在内的许多抗病相关蛋白的产生，激活植物防御机制。
[0004]NPR1具有转录激活的作用，正向调控下游防御相关基因的表达，NPR3/4具有转录共抑制子的功能，负向调控下游相关基因的表达。当植物体内SA含量升高时，SA会促进NPR1与转录因子TGA结合启动PR基因转录，与此同时，水杨酸抑制NPR3/4与转录因子TGA的结合，进而解除NPR3/4对基因转录反应的抑制。OsNPR1与拟南芥中NPR1同源性最高，但两者在应对不同类型病原菌侵染过程中却发挥着不同的作用。例如：研究表明拟南芥中NPR1正调控植物对细菌的侵染，而负调控植物对真菌的抗性。然而，目前关于水稻病毒与OsNPR1的关系未见研究报道。
[0005]本专利技术的专利技术人以OsNPR1基因为对象，通过构建pCV1300
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OsNPR1的过表达载体，进一步将构建好的表达载体通过农杆菌(GV3101)介导转化水稻日本晴NIP成熟胚诱导形成的愈伤组织。获得T0代转基因水稻种子后，继续扩繁，得到T1代的种子，通过实时荧光定量PCR技术检测OsNPR1在水稻中的表达量，从而获得稳定遗传的高表达转基因植株。
[0006]实验结果表明：接种RBSDV的OsNPR1过表达转基因植株，包括发病植株的症状、发病率以及病毒在RNA水平上的表达量都显著低于感病野生对照NIP植株。由此可见，OsNPR1转基因水稻能显著增强水稻对RBSDV侵染的抗性；OsNPR1过表达转基因植株在转基因领域具有很好的应用价值。本专利技术对培育抗水稻黑条矮缩病的转基因植物具实际指导意义，对
植物病害防治领域也有重要的应用前景。

技术实现思路

[0007]本专利技术涉及一种水稻水杨酸途径重要调控因子OsNPR1基因及其编码蛋白；
[0008]所述OsNPR1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，由这一类水稻调控因子编码基因OsNPR1对应的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所编码的氨基酸。
[0009]在一些具体的实施方案中，OsNPR1基因的核苷酸序列如下：
[0010]OsNPR1(SEQ ID NO:1)
[0011]ATGGAGCCGCCGACCAGCCACGTCACCAACGCGTTCTCCGACTCGGACAGCGCGTCCGTGGAGGAGGGGGGCGCCGACGCGGACGCCGACGTGGAGGCGCTCCGCCGCCTCTCCGACAACCTCGCCGCGGCGTTCCGCTCGCCCGAGGACTTCGCGTTCCTCGCCGACGCGCGCATCGCCGTCCCGGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGACCTGCTGGTGCACCGCTGCGTGCTCTCCGCGCGGAGCCCCTTCCTGCGCGGCGTCTTCGCGCGCCGCGCCGCCGCCGCCGCAGGCGGCGGCGGCGAGGATGGCGGCGAGAGGCTGGAGCTCCGGGAACTCCTCGGCGGCGGCGGCGAGGAGGTGGAGGTCGGGTACGAGGCGCTGCGGCTGGTGCTCGACTACCTCTACAGCGGCCGCGTCGGCGACCTGCCCAAGGCGGCGTGCCTCTGCGTCGACGAGGACTGCGCCCACGTCGGGTGCCACCCCGCCGTCGCGTTCATGGCGCAGGTCCTCTTCGCCGCCTCCACCTTCCAGGTCGCCGAGCTCACCAACCTCTTCCAGCGGCGTCTCCTTGATGTCCTTGATAAGGTTGAGGTAGATAACCTTCTATTGATCTTATCTGTTGCCAACTTATGCAACAAATCTTGCATGAAACTGCTTGAAAGATGCCTTGATATGGTAGTCCGGTCAAACCTTGACATGATTACTCTTGAGAAGTCATTGCCTCCAGATGTTATCAAGCAGATTATTGATGCACGCCTAAGCCTCGGATTAATTTCACCAGAAAACAAGGGATTTCCTAACAAACATGTGAGGAGGATACACAGAGCCCTTGACTCTGACGATGTAGAGCTAGTCAGGATGCTGCTCACTGAAGGACAGACAAATCTTGATGATGCGTTTGCACTGCACTACGCCGTCGAACATTGTGACTCCAAAATTACAACCGAGCTTTTGGATCTCGCACTTGCAGATGTTAATCATAGAAACCCAAGAGGTTATACTGTTCTTCACATTGCTGCGAGGCGAAGAGAGCCTAAAATCATTGTCTCCCTTTTAACCAAGGGGGCTCGGCCAGCAGATGTTACATTCGATGGGAGAAAAGCGGTTCAAATCTCAAAAAGACTAACAAAACAAGGGGATTACTTTGGGGTTACCGAAGAAGGAAAACCTTCTCCAAAAG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.OsNPR1基因在抗斐济病毒属病毒作物育种中的应用，所述基因序列如：SEQ ID NO:1所示。2.权利要求1所述的应用，编码所述OsNPR1基因的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。3.权利要求1
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2任一项所述的应用，所述斐济病毒属(Fijivirus)优选玉米粗缩病毒(Maize Rough Dwarf Virus，MRDV)、水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus，RBSDV)、南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black streaked dwarf virus，SRBSDV)；所述斐济病毒属最优选水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)。4.权利要求1
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3任一项所述的应用，所述作物优选水稻，玉米，小麦，燕麦和大麦；更优选水稻，最优选日本晴。5.一种水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)转基因水稻的制备方法，其步骤包括：(1)构建水稻过表达OsNPR1载体设计带有BamHI及SacI酶切位点的引物去扩增权利要求1所述OsNPR1基因；用BamHI、SacI酶对pCV1300载体进行双酶切；酶切位点的引物，用于OsNPR1双元表达载体PCV1300构建，引物序列如下：PCV
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OsNPR1
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F:GTTCCAGATTACGCTGGATCCATGGAGCCGCCGACCAGCCASEQ ID NO:5PCV
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OsNPR1
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R:ATCGGGGAAATTCGAGCTCTCATCTCCTTGGTCGAATGGCSEQ ID NO:6酶切PCV1300载体后，将上述引物扩增PCR产物分别与载体连接；挑选阳性克隆，进行测序确认已成功构建PCV1300
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OsNPR1表达载体；(2)EHA105农杆菌的培养与水稻愈伤组织诱导培养：取
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80℃冰箱保存的含有目基因载体的质粒PCV1300
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OsNPR1转化根瘤农杆菌EHA105；详细的操作步骤如下，首先吸取1μL质粒加到100μL感受态细胞中，吹打混匀，加入4℃提前遇冷的电极杯中，2200V的电压转化，加入500μL无抗性的LB液体培养基，28℃，200rpm培养2
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3h，涂布于含有50μg/ml...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙宗涛，张合红，魏中艳，李雁军，谢凯丽，陈剑平，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：