一种低柠檬酸型猕猴桃种质资源的创制方法技术

本发明专利技术提供一种低柠檬酸型猕猴桃种质资源的创制方法，即以调控柠檬酸合成的关键基因AcNAC1为靶标，结合CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种低柠檬酸型猕猴桃种质资源的创制方法


[0001]本专利技术属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及一种低柠檬酸型猕猴桃种质资源的创制方法。该猕猴桃种质资源生产的果实中柠檬酸含量极低，适用于猕猴桃果实有机酸代谢的机制研究，以及改良果实风味的育种研究。

技术介绍

[0002]猕猴桃(Actinidia spp.)是一种世界范围内的经济型水果，因其丰富的生物活性物质和独特的风味，被誉为“水果之王”。有机酸是一类常见的植物初生代谢产物及代谢中间产物，是影响果实风味的重要指标之一，不仅决定了果实的感官品质，还影响次生代谢途径及采后货架性能。不同物种果实的有机酸组分种类繁多，同时含量也存在较大的差异，根据成熟果实中积累的主要有机酸，可大体分为苹果酸优势型、柠檬酸优势型和酒石酸优势型。成熟的猕猴桃果实中主要的有机酸组分为柠檬酸、奎宁酸和苹果酸，其中柠檬酸占总酸的比例为40
‑
60％，奎宁酸为40
‑
60％，苹果酸为10％。这一占比又因品种的不同而存在差异，也是不同品种的猕猴桃果实风味不同的重要原因。
[0003]改变有机酸组分的种类或者含量，是改良果实风味育种研究的工作核心之一。然而，果实有机酸具有明显的数量性状遗传特征，包括杂交后代表型受环境影响显著、变异呈现连续性、由多个基因控制，遗传方式复杂，等。给利用杂交育种手段改变特定有机酸组分造成极大困难。

技术实现思路

[0004]本专利技术为解决杂交育种遭遇的瓶颈问题提供了一种技术途径，提供一种低柠檬酸型猕猴桃种质资源的创制方法，得到的种质资源材料不仅适用于猕猴桃果实有机酸代谢的机制研究，还适用于改良果实风味的育种研究。
[0005]一种低柠檬酸型猕猴桃种质资源的创制方法，以调控柠檬酸合成的关键基因AcNAC1(核苷酸序列为SEQ ID NO.2，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.3)为靶标，至少包括下列步骤：
[0006]第一步，依据AcNAC1基因组序列(SEQ ID NO.1)设计并合成两个靶点gRNA序列(SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5)，进而构建成重组CRISPR
‑
Cas9表达载体；
[0007]第二步，将重组CRISPR
‑
Cas9表达载体借助于农杆菌介导的转基因技术转化到
‘
东红
’
猕猴桃叶盘中，结合植物组织培养技术获得转基因猕猴桃；
[0008]第三步，利用基因序列测序技术分析所获得转基因猕猴桃中AcNAC1基因组序列的变化情况，筛选出因AcNAC1基因组序列突变导致编码的氨基酸序列发生变化、进而导致AcNAC1基因功能缺失的转基因猕猴桃种质材料，其中导致基因功能缺失的AcNAC1序列突变情况包括编码序列的移码突变和提前终止；
[0009]第四步，检测出AcNAC1基因功能缺失型果实中柠檬酸含量自坐果至成熟的完整发育过程中变化不大，始终处于较低水平，仅为
‘
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’
的15
‑
20％，确定所得AcNAC1基因功能
缺失型猕猴桃种质材料为低柠檬酸型猕猴桃种质资源。
[0010]本专利技术所创制的低柠檬酸型猕猴桃种质资源植株生长无显著特殊性，对肥水等栽培管理措施无特殊要求。低柠檬酸型猕猴桃种质资源的创制为培育特异有机酸型猕猴桃种质资源、培育优良猕猴桃品种提供了一种高效的参照方式。其他与AcNAC1基因序列相似度高于90％的功能基因在此方面的应用，同样在本专利技术专利的保护范围内。
[0011]本专利技术在鉴定出控制猕猴桃柠檬酸合成的关键基因AcNAC1基础上，结合CRISPR
‑
Cas9基因编辑和猕猴桃组织培养技术，靶向精准的创制出果实柠檬酸含量极低的猕猴桃种质材料。这一创制方法是解决杂交育种遭遇的瓶颈问题的行之有效的策略，即：鉴定出控制数量性状的主效基因，结合CRISPR
‑
Cas9技术，创制创新果树品种。本专利技术提供的种质资源创制方法，设计合理，操作简单，可有效突破常规杂交育种遭遇的杂交表型随机性的瓶颈问题，为靶向精准的创制创新猕猴桃品种提供了有效策略。
附图说明
[0012]附图1是AcNAC1基因编辑的靶点1和靶点2。
[0013]附图2是acnac1突变靶点的测序结果。
[0014]附图3是
‘
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和低柠檬酸型猕猴桃不同发育时期果实图。
[0015]附图4是
‘
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植株和低柠檬酸型猕猴桃植株的长势比较图。
[0016]附图5是
‘
东红
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低柠檬酸型猕猴桃果实发育阶段的柠檬酸含量比较。具体实施方法
[0017]本专利技术结合附图和结合农杆菌介导的猕猴桃转基因方法为例，详细阐述低柠檬酸型种质材料的创制过程。
[0018]实施例1.AcNAC1基因编辑的猕猴桃种质资源的创制
[0019]一.研究方法：
[0020]1.CRISPR
‑
Cas9基因编辑载体构建及农杆菌转化利用CRISPR
‑
P网站，在AcNAC1基因外显子上设计2个靶序列，2个所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示(如附图1所示)；然后将AtU6
‑
26启动子连同包含2个所述靶序列的sgRNA序列AtU6
‑
26
‑
tRNA
‑
gRNA1
‑
tRNA
‑
gRNA2进行基因合成后，搭载到基因编辑载体pDE
‑
KRS，得到AcNAC1基因编辑载体；将经过测序确认正确的AcNAC1基因编辑载体通过电击或液氮冻融等方法转化到宿主细胞根癌农杆菌EHA105中，挑出农杆菌单克隆菌斑保存菌液至
‑
80℃超低温冰箱中保存备用。
[0021]2.猕猴桃遗传转化与检测利用上述制备的宿主细胞农杆菌侵染
‘
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猕猴桃的子叶外植体，通过诱导愈伤，抗性诱导分化以及生根培养获得组培苗。提取植株基因组DNA，利用PCR和测序技术验证，筛选出AcNAC1基因突变猕猴桃植株。扩增含上述靶序列1的基因片段的AcNAC1
‑
F1引物序列如SEQ ID NO.6所示；扩增含上述靶序列1的基因片段的AcNAC1
‑
R1引物序列如SEQ ID NO.7所示；扩增含上述靶序列2的基因片段的AcNAC1
‑
F2引物序列如SEQ ID NO.8所示；扩增含上述靶序列2的基因片段的AcNAC1
‑
R2引物序列如SEQ ID NO.9所示。
[0022]二.研究结果：经过测序发现，与
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猕猴桃中AcNAC1核苷酸序列SEQ ID NO.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种低柠檬酸型猕猴桃种质资源的创制方法，其特征在于：以调控柠檬酸合成的关键基因AcNAC1为靶标，至少包括下列步骤：第一步，依据AcNAC1基因组序列设计并合成两个靶点gRNA序列，进而构建成重组CRISPR
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Cas9表达载体；第二步，将重组CRISPR
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Cas9表达载体借助于农杆菌介导的转基因技术转化到
‘
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猕猴桃叶盘中，结合植物组织培养技术获得转基因猕猴桃；第三步，分析所获得转基因猕猴桃中AcNAC1基因组序列的变化情况，筛选出因AcNAC1基因组序列突变导致编码的氨基酸序列发生变化、进而导致AcNAC1基因功能缺失的转基因猕猴桃种质材料；第四步，检测出AcNAC1基因功能缺失型果实中柠檬酸含量仅为
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的15
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20％，确定所得AcNAC1基因功能缺失型猕猴桃种质材料为低柠檬酸型猕猴桃种质...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷学仁，傅蓓凌，王文球，刘晓芬，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：