本发明专利技术公开一种基于碳点和Au@Ag2S共振能量转移检测急早幼粒PML/RARα融合基因的电致化学发光传感器。采用碳点作为电致化学发光试剂，通过形成CDs/PAMAM/还原石墨烯复合物（CDs/PAMAM/rGO），将CDs修饰在电极表面，利用Au@Ag2S纳米粒子（Au@Ag2S NPs）对CDs的电致化学发光（ECL）信号的共振能量转移，高效率猝灭CDs的ECL信号，结合捕获DNA探针与靶标DNA、Au@Ag2S NPs标记辅助DNA探针杂交，形成“三明治”结构，建立了一种用于急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因检测的ECL生物传感器，所构建的ECL生物传感器具有简便、成本低、灵敏度较高等优点，有望成为急性早幼粒细胞白血病诊疗的工具。的工具。的工具。
【技术实现步骤摘要】
一种基于碳点和Au@Ag2S共振能量转移检测急早幼粒PML/RAR
α
融合基因的电致化学发光传感器
[0001]本专利技术涉及一种基于碳点和Au@Ag2S共振能量转移检测急早幼粒PML/RARα融合基因的电致化学发光传感器，属于检验
，该生物传感器可用于急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因的检测。
技术介绍
[0002]急性早幼粒细胞白血病（Acute promyelocytic leukemia, APL）临床上表现十分凶险，是人体造血组织的一种恶性疾病，它的发病速度快，迅速恶化，死亡率高，治疗十分困难，严重危害人们身体健康。绝大多数APL患者具有特征性的t (17;15) (q21; q22) 染色体易位现象，使得位于17号染色体上的RARα基因与位于15号染色体上的PML基因发生重排，导致PML/RARα融合基因的生成，抑制了PML和RARα基因的正常功能，影响细胞的增殖和分化。该融合基因已经成为APL特异性的标志基因，PML/RARα的定量分析检测对APL的早期临床诊断、治疗及预后监测至关重要。
[0003]碳点（CDs）是一种粒径大小在10 nm以下的，具有良好分散性的环境友好型纳米颗粒，由于其在生物相容性、水溶性方面表现突出，同时还具备低细胞毒性和制备成本等优势，引起了广大研究者的热切关注。特别是它还具有独特的光学性质，如电致化学发光、化学发光、荧光等性质，使CDs在生物医药、光学器件和生物传感等领域具有广泛应用
]。因此，CDs作为一种新型的ECL发光探针逐渐应用到各种各样的ECL分析检测体系。碳点表面有大量的含氧官能团（比如羧基和羟基等），使得碳点都具有良好的水溶性，直接滴涂在电极表面极易脱落，为了解决水溶性碳点在固态ECL生物传感器的应用所存在问题，可通过寻找优异的固载材料来实现。利用固载材料将CDs牢固地修饰于电极上，产生稳定ECL信号响应。石墨烯具有杰出的导电能力和电子传递能力，比表面积大等特点，可以成为CDs的理想固载材料并应用在电致化学发光传感器中。利用聚酰胺
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胺型树枝状高分子化合物（polyamidoamine，PAMAM）来还原氧化石墨烯（GO），制得表面富含氨基的还原型石墨烯（reduced graphene oxide，rGO）复合材料（PAMAM/rGO），利用EDC/NHS活化偶联，合成CDs/PAMAM/rGO复合物，PAMAM被引入ECL传感界面，在实现CDs在电极表面固载的同时，还可作为共反应试剂增强体系ECL发光信号。
[0004]电致化学发光（ECL）反应过程有电化学和化学发光两个阶段，其具备了两者的分析优势。该方法具有仪器装置简单、背景信号低、选择性强、试剂成本低和线性范围广等优势，受到了人们的广泛关注。电致化学发光共振能量转移技术（Electrochemiluminescence resonance energy transfer，ECL
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RET）是将电致化学发光作为供体光源应用在共振能量转移系统中，近年来被广泛研究，具有巨大研究潜能。它具备很多显著的优点：无需要激发光源，可以减小背景噪音，也不易发生釆用染料作为供体或受体时光漂白、光散射、受体自身直接激发等现象。
[0005]本专利技术公开一种基于碳点和Au@Ag2S共振能量转移检测急早幼粒PML/RARα融合基
因的电致化学发光传感器。利用制备的碳点做ECL能量供体，Au@Ag2S核壳纳米粒子（Au@Ag2S NPs）做能量转移的受体，设计了一种“三明治”结构的电致化学发光生物传感器用于急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因的检测。
技术实现思路
[0006]1. 本专利技术的目的是提供一种基于碳点和Au@Ag2S共振能量转移检测急早幼粒PML/RARα融合基因的电致化学发光传感器。
[0007]2. 本专利技术所述的电致化学发光生物传感器，基于电致化学发光共振能量转移原理，碳点为ECL能量供体，Au@Ag2S核壳纳米粒子为能量转移的受体，利用Au@Ag2S 核壳纳米粒子对CDs的ECL信号的高效率猝灭，结合DNA
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三明治”结构，构建了电致化学发光生物传感器，成功实现急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因的定量检测。
[0008]3. 本专利技术的一种基于碳点和Au@Ag2S共振能量转移检测急早幼粒PML/RARα融合基因的电致化学发光传感器的制备方法，依序包括如下步骤：（1）碳点（CDs）的合成本实验用碳纤维作为前驱体，采用硝酸为氧化剂，利用加热回流法合成CDs。实验过程如下：精确称取的750 mg碳纤维剪成细碎小段后，置于250 mL三颈圆底烧瓶中，于圆底烧瓶加入150 mL 7.5 M的硝酸溶液，使用球形冷凝管冷凝回流，油浴锅加热至圆底烧瓶中反应溶液沸腾，以溶液沸腾开始计时，反应12个小时后，结束反应，自然冷却至室温，收集反应后的溶液。加入适量的NaOH固体，将合成的CDs溶液pH调至中性后，以8000 rpm的转速离心10 min ，以去除沉淀。然后依次用微孔滤膜过滤（0.45 μm和0.22 μm）去除杂质，将过滤溶液装入截留分子量（Molecular Weight Cut
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off，MWCO）为1000 Dalton的透析袋中透析48小时除去小分子盐。再将充分透析后的溶液用截留分子量为 3 kD的超滤管超滤（10000 rpm，30 min），收集大于3 kD的溶液即为实验所需要的碳点，经过旋蒸浓缩，冷冻干燥后，得到一定质量的CDs固体，最后用超纯水配制成高浓度CDs母液，置于4 ℃下保存，备用。
[0009]（2）CDs/PAMAM/rGO复合物的制备首先，PAMAM/rGO由以下方法制得：称取6 mg的GO配制成1 mg/mL水溶液，超声分散均匀（500 W、5 h），将其移入干净的三颈圆底烧瓶中，搅拌下慢慢加入6 mL PAMAM溶液（1 mg/mL），置于油浴锅中120 ℃下加热冷凝回流反应1h，反应结束后，冷却至室温，将反应液离心，沉淀洗涂3
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5次，洗去多余PAMAM，将沉淀冷冻干燥后得到黑色粉末样品。
[0010]取300 μL上述制备的CDs，加入适量EDC、NHS混合溶液，室温下搅拌反应0.5小时后加入180 μL的PAMAM/rGO溶液，持续搅拌反应12小时。最后将所得沉淀离心洗涤得到CDs/PAMAM/rGO固体，将其均匀分散在480 μL的超纯水中，4 ℃下保存，备用。
[0011]（3）Au@Ag2S核壳纳米粒子的制备Au纳米粒子（AuNPs）合成：取1 mL 1%柠檬酸钠快速加入到100 mL沸腾的0.01%的HAuCl4溶液中，搅拌反应10 min，即得到酒红色的AuNPs。然后以AuNPs为晶种，继续合成Au@Ag NPs：取以上AuNPs 50 mL煮沸并大力搅拌，向沸腾的AuNPs 中加入1 mLAgNO3溶液（4 mg/mL），接着逐滴加入1mL 1 %柠檬酸钠，继续沸腾1 h，溶本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于碳点和Au@Ag2S共振能量转移检测急早幼粒PML/RARα融合基因的电致化学发光传感器，其特征在于，包括作为电致化学发光共振能量转移中的供体碳点/PAMAM/还原石墨烯CDs/PAMAM/rGO，作为共振能量转移中的受体金
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硫化银核壳纳米粒子Au@Ag2S NPs，利用Au@Ag2S NPs对碳点ECL的高效率猝灭，结合捕获DNA探针与靶标DNA、Au@Ag2S NPs标记辅助DNA探针杂交，形成“三明治”结构，建立一种高敏感性及选择性的电致化学发光传感器，能用于急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因的定量检测。2.权利要求1所述的一种基于碳点和Au@Ag2S共振能量转移检测急早幼粒PML/RARα融合基因的电致化学发光传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）玻碳电极GCE依次在1.0、0.3和0.05 μm的Al2O3粉末中打磨、抛光，然后分别放入1:1 HNO3、无水乙醇及超纯水中超声并用N2吹干；随后，将5
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L分散好的 CDs/PAMAM/rGO溶液均匀地滴涂到GCE表面，放入烘箱中45 ℃烘干成膜，制得CDs/PAMAM/rGO修饰电极；（2）CDs/PAMAM/rGO修饰电极浸入到1 mL含有20 mg EDC和10 mg NHS的混合溶液中，活化0.5 h后，用超纯水冲洗干净，氮气吹干；然后，在CDs/PAMAM/rGO修饰电极表面滴加8
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L捕获DNA探针，室温下自组装2 h 后，用，Tris
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HCl缓冲液冲洗，氮气吹干，捕获DNA探针通过酰胺键组装在CDs/PAMAM/rGO修饰的玻碳电极CDs/PAMAM/rGO/GCE表面，制得ssDNA/CDs/PAMAM/rGO修饰电极；（3）将制备好的ssDNA/CDs/PAMAM/rGO修饰电极放入到100
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L含有Au@Ag2S NPs标记辅助DNA探针DNA
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Au@Ag2S NPs和目标DNA的杂交溶液中，37 ℃下杂交1小时后，此时，捕获DNA探针与靶标DNA、Au@Ag2S NPs标记辅助DNA探针杂交，形成“三明治”结构，取出此结构的电极并用pH 7.40的Tris
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HCl 缓冲液清洗，氮气吹干，制得dsDNA/CDs/PAMAM/rGO修饰电极；再进行电致化学发光的检测，Au@Ag2S NPs与固载在dsDNA/CDs/PAMAM/rGO修饰电极表面的CDs靠近，可对碳点电致化学发光信号产生猝灭效应，根据“三明治”结构形成前后ECL信号的变化值，实现对急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因靶标DNA的高灵敏定量检测。3.根据权利要求1或2所述的一种基于碳点和Au@Ag2S共振能量转移检测急早幼粒PML/RARα融合基因的电致化学发光传感器，其特征在于，所述CDs/PAMAM/rGO材料的制备，包括如下步骤：称取氧化石墨烯G...
【专利技术属性】
技术研发人员：雷云，刘爱林，林木土，张子阳，韩舒桦，张宇，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：
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