一种重组μ-芋螺毒肽及其制备方法技术

一种重组μ

【技术实现步骤摘要】
一种重组
μ
‑
芋螺毒肽及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种重组μ
‑
芋螺毒肽及其制备方法。

技术介绍

[0002]芋螺毒素(conotoxin或conopeptide或CTX)，由海洋腹足纲软体动物芋螺(Conus)的毒液管和毒囊内壁的毒腺所分泌，由许多单一毒肽组成的混合毒素，主要成分是一些对不同离子通道及神经受体高度专一性的活性多肽化合物。芋螺毒素多数由10
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40个氨基酸残基组成，富含两对或三对二硫键，是发现的最小核酸编码的动物神经毒素肽，也是二硫键密度最高的小肽，可作用于各种离子通道和受体的类型及亚型。与其他天然肽类毒素相比，芋螺毒素具有相对分子质量小、结构稳定、高活性、高选择性等突出优点。
[0003]根据芋螺毒素基因及其前体蛋白信号肽的保守性，可将芋螺毒素分为A、O、T、M、P、I等多个超家族。α、αA、κA属于A
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超家族，ω、δ、κ、μO属于O
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超家族，μ、ψ、ΚM属于M
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超家族。天然的μ
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芋螺毒肽是由22个氨基酸构成，分子中有三对二硫键，其连接方式为Cys13
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Cys15、Cys4
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Cys21、 Cys10
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Cys22，其结构高度折叠，穿透力强，具有强效的抑制肌肉收缩的作用，因此具有迅速即时祛皱效果。
[0004]目前，制备芋螺毒素的方法主要有天然提取和人工化学合成。通过天然芋螺毒管中直接提取，这种方法获取的产量非常少，而且由于海洋生态的破坏使得野生芋螺数量急剧减少，使用该方法会进一步加剧芋螺资源恶化，因此采用天然分离提取获得芋螺毒素用于研究和工业化生产使用并不现实。人工化学合成的方法，即采用分离天然芋螺毒素后测序获得芋螺毒素序列，然后采用人工化学合成获得更多量的芋螺毒素。由于天然芋螺毒素含有特定的二硫键连接方式，因此如何合成特定二硫键连接方式的多肽成为合成中最大的难题，也成为限制获得大量天然芋螺毒素的关键因素。
[0005]随着生物技术的发展，采用基因工程的方法，将芋螺毒素的基因转化到微生物中使其表达，后期再进行分离纯化，可望生产出大量高性价比的重组芋螺毒素。但芋螺毒肽作为毒性蛋白，其在大肠杆菌表达的同时会影响宿主菌株的生长繁殖，使其表达产量降低，无法满足工业化生产。同时因芋螺毒素毒性较高，其安全性无法满足医药、化妆品领域的实际应用。如何生产出产量高且毒性低的芋螺毒素成为现阶段亟需解决的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的在于提供一种重组μ
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芋螺毒肽及其制备方法，以解决重组μ
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芋螺毒肽在大肠杆菌中表达产量低、活性低、毒性高的技术问题。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术的一种重组μ
‑
芋螺毒肽的制备及其应用的具体技术方案如下：一种重组μ
‑
芋螺毒肽，包括如下氨基酸序列：（Ⅰ）芋螺毒肽氨基酸序列；（Ⅱ）类固醇异构酶序列；优选地，所述的（Ⅰ）μ
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芋螺毒肽（μ
‑
CTX）氨基酸序列如SEQ NO 1所示；
优选地，所述的（Ⅱ）类固醇异构酶（KSI）氨基酸序列如SEQ NO 2所示；优选地，所述的μ
‑
芋螺毒肽（μ
‑
CTX）融合类固醇异构酶（KSI）以及纯化标签（6
×
His）、酶切位点（肠激酶酶切位点）的HIS
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KSI
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μ
‑
CTX氨基酸序列如SEQ NO 3所示。
[0008]本专利技术的第二专利技术目的是提供一种重组μ
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芋螺毒肽的制备方法，步骤如下：步骤一，菌株的构建与试表达；步骤二，菌株的发酵培养；步骤三，蛋白的分离纯化。
[0009]其中，步骤一菌株的构建与试表达包括如下过程： A1基因的设计与合成，A2载体的单酶切，A3基因片段与载体片段连接，A4连接产物转化至DH5α感受态细胞中，A5菌落鉴定，A6鉴定菌落的质粒提取，A7质粒转化至表达菌株感受态细胞中，A8表达菌株在试管中的小试培养，A9试管培养菌体的试表达验证；优选的，步骤A2中所述的载体为pET
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28载体；优选的，步骤A2中所述单酶切所使用内切酶为NcoI；优选的，步骤A7中所述的表达菌株感受态细胞为ER2566。
[0010]步骤二，菌株的发酵培养包括如下过程： B1发酵种子的培养，B2种子转接至发酵罐培养基中，B3培养至对数期进行IPTG诱导表达，B4继续培养4小时，离心收集菌体；优选的，B3中所述的IPTG诱导浓度为1
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2mM。
[0011]第三步，蛋白的分离纯化包括如下过程：C 1菌体均质破碎，C2梯度离心法，收集包涵体，并进行包涵体洗涤，C3包涵体复溶，变性条件下NI柱亲和层析，C4纯化后的蛋白梯度去除变性剂，进行蛋白复性，C5复性后的蛋白进行肠激酶酶切，切除KSI融合标签，C6切除后的蛋白进行NI柱亲和层析进一步纯化，收集未结合NI柱部分即为μ
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CTX蛋白，C7置换蛋白缓冲液。
[0012]优选的，C3中包涵体复溶buffer与破碎菌体比例为5
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10:1（v：g）；优选的，C4中所述的复性方法为梯度透析，其中使用buffer分别为50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，4M urea，pH=8.0；50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，2M urea，pH=8.0；50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，pH=8.0；25mM Tris，pH=8.0。或者为50mM Tris，300mM NaCl，1mM DTT，4M urea，pH=8.0；50mM Tris，300mM NaCl，0.5mM GSH，0.1mM GSSG，2M urea，pH=8.0；50mM Tris，300mM NaCl，0.5mM GSH，0.1mM GSSG，pH=8.0；25mM Tris，pH=
8.0；优选的，C5中肠激酶酶切条件为1U的肠激酶酶切50ug蛋白，于16度条件下酶切24小时或者为1U的肠激酶酶切50ug蛋白，于4度条件下酶切72小时；优选的，C7中所述的置换方法为使用G25脱盐层析置换缓冲液为25mM PB，pH=7.4或者为透析的方法，使用截留分子量为1KD的透析袋进行透析置换为25mM PB，pH=7.4。
[0013]本专利技术的一种重组μ
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芋螺毒肽及其制备方法具有以下优势：（1）芋螺毒肽因其本身为毒性蛋白质。在采用异源表达时常常会因为其自身的生物活性导致异源表达的宿主菌株生长繁殖受到影响，降低表达产量。本专利技术中将μ
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芋螺毒肽（μ
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CTX）融合类固醇异构酶标签（KSI），具有促进蛋白质本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组μ
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芋螺毒肽，其特征在于，包括如下氨基酸序列：（Ⅰ）芋螺毒肽氨基酸序列；（Ⅱ）类固醇异构酶序列。2.根据权利要求1所述的一种重组μ
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芋螺毒肽，其特征在于，所述的（Ⅰ）μ
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芋螺毒肽（μ
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CTX）氨基酸序列如SEQ NO 1所示，所述的（Ⅱ）类固醇异构酶（KSI）氨基酸序列如SEQ NO 2所示，所述的μ
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芋螺毒肽（μ
‑
CTX）融合类固醇异构酶（KSI）以及纯化标签（6
×
His）、酶切位点（肠激酶酶切位点）的HIS
‑
KSI
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μ
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CTX氨基酸序列如SEQ NO 3所示。3.根据权利要求1所述的一种重组μ
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芋螺毒肽的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：步骤一，菌株的构建与试表达；步骤二，菌株的发酵培养；步骤三，蛋白的分离纯化。4.根据权利要求3所述的一种重组μ
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芋螺毒肽的制备方法，其特征在于，步骤一包括如下过程：A1基因的设计与合成;A2载体的单酶切;A3基因片段与载体片段连接;A4连接产物转化至DH5α感受态细胞中;A5菌落鉴定;A6鉴定菌落的质粒提取;A7质粒转化至表达菌株感受态细胞中;A8表达菌株在试管中的小试培养;A9试管培养菌体的试表达验证;步骤二包括如下过程：B1发酵种子的培养;B2种子转接至发酵罐培养基中;B3培养至对数期进行IPTG诱导表达;B4继续培养4小时，离心收集菌体;步骤三包括如下过程：C 1菌体均质破碎;C2梯度离心法，收集包涵体，并进行包涵体洗涤;C3包涵体复溶，变性条件下NI柱亲和层析;C4纯化后的蛋白梯度去除变性剂，进行蛋白复性;C5复性后的蛋白进行肠激酶酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨春雨，李磊，刘一琳，王培培，郑春阳，
申请(专利权)人：守正创新生物科技天津有限公司，
类型：发明
国别省市：