用于切割靶DNA的组合物及其用途制造技术

本发明专利技术涉及真核细胞或生物体中的靶向基因组编辑。更具体地，本发明专利技术涉及用于在真核细胞或生物体中切割靶DNA的组合物及其用途，所述组合物包含特异于靶DNA的向导RNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。质编码核酸或Cas蛋白质。质编码核酸或Cas蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
用于切割靶DNA的组合物及其用途
[0001]本申请是申请日为2013年10月23日的、专利技术名称为“用于切割靶DNA的组合物及其用途”的中国专利申请CN 201910950792.1的分案申请。


[0002]本专利技术涉及真核细胞或生物体中的靶向基因组编辑。更具体地说，本专利技术涉及一种用于在真核细胞或生物体中切割靶DNA的组合物及其用途，所述组合物包括特异于靶DNA的向导RNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。

技术介绍

[0003]CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)是含有多个短同向重复的基因座，其被发现存在于约40％测序细菌的基因组中和90％测序古细菌的基因组中。CRISPR作为原核的免疫系统发挥功能，其赋予对外来遗传元件例如质粒和噬菌体的抵抗性。CRISPR系统提供了一种获得性免疫形式。外源DNA的短片段(称为间隔区)整合在CRISPR重复序列之间的基因组中，作为过去暴露的记忆。然后CRISPR间隔区以类似于真核生物中RNAi的方式用于识别和沉默外来遗传元件。
[0004]Cas9，II型CRISPR/Cas系统中一种重要的蛋白质成分，当与称为CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的两个RNA复合时，形成活性核酸内切酶，从而切断入侵噬菌体或质粒中的外源遗传元件，以保护宿主细胞。crRNA从宿主基因组中的CRISPR元件转录，其中该CRISPR元件之前自外源入侵物捕获。最近，Jinek等(1)证明，通过融合crRNA和tracrRNA的必要部分产生的单链嵌合RNA可以取代Cas9/RNA复合体中的两个RNA以形成功能性核酸内切酶。
[0005]CRISPR/Cas系统相对于锌指和转录激活因子样效应物DNA结合蛋白提供了优势——因为在核苷酸结合CRISPR
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Cas蛋白中的位点特异性由RNA分子调控而不是DNA结合蛋白调控(这在设计和合成上是更具挑战性的)。
[0006]然而，到现在为止，尚未开发出使用基于CRISPR/Cas系统的RNA向导核酸内切酶(RGEN)的基因组编辑方法。
[0007]同时，限制性片段长度多态性(RFLP)是最古老，最方便，和最便宜的基因分型方法之一，其仍然广泛应用于分子生物学和遗传学，但其往往受限于缺乏适当的限制性内切酶识别位点。
[0008]可以通过各种方法检测由工程化核酸酶诱导的突变，其中包括错配敏感的T7核酸内切酶I(T7E1)或Surveyor核酸酶测定法，RFLP，荧光PCR产物的毛细管电泳，双脱氧测序和深度测序。T7E1和Surveyor测定法广泛使用，但很繁琐。此外，这些酶倾向于低估突变频率，这是因为突变序列可彼此形成同源双链，从而不能从野生型细胞中区分纯合双等位基因突变体克隆。RFLP没有这些限制，因而是首选的方法。实际上，RFLP是检测细胞和动物中由工程化核酸酶介导的突变的最早方法之一。然而，不幸的是，RFLP受限于适当限制性位点的可得性。在所关注的靶位点有可能没有限制性位点。

技术实现思路

[0009]技术问题
[0010]到现在为止，尚未开发使用基于CRISPR/Cas系统的RNA向导核酸内切酶(RGEN)进行基因组编辑和基因分型的方法。
[0011]在这种情况下，本专利技术人进行了大量努力来开发基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑方法，最终建立了一个可程序化的RNA向导核酸内切酶，该RNA向导核酸内切酶可以在真核细胞和生物体中以靶向方式切割DNA。
[0012]另外，本专利技术人进行了大量努力，开发一种新的在RFLP分析中利用RNA向导核酸内切酶(RGEN)的方法。其利用RGEN，对癌症中发现的以及细胞和生物体中由工程化核酸酶(包括RGEN自身)诱导的频发突变进行基因分型，从而完成了本专利技术。
[0013]技术方案
[0014]本专利技术的一个目的是提供一种在真核细胞或生物体中切割靶DNA的组合物，其包括特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
[0015]本专利技术的另一个目的是提供一种在真核细胞或生物体中诱导靶向诱变的组合物，其包括特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
[0016]本专利技术的另一个目的是提供一种在真核细胞或生物体中切割靶DNA的试剂盒，其包括特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
[0017]本专利技术的另一个目的是提供一种在真核细胞或生物体中诱导靶向诱变的试剂盒，其包括特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
[0018]本专利技术的再一目的是提供一种制备含有Cas蛋白质和向导RNA的真核细胞或生物体的方法，所述方法包括用Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质以及向导RNA或编码向导RNA的DNA共转染或顺序转染真核细胞或生物体的步骤。
[0019]本专利技术的另一个目的是提供一种真核细胞或生物体，其含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
[0020]本专利技术的另一个目的是提供一种在真核细胞或生物体中切割靶DNA的方法，所述方法包括步骤：用组合物转染含有靶DNA的真核细胞或生物体，所述组合物含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
[0021]本专利技术的另一个目的是提供一种在真核细胞或生物体中诱导靶向诱变的方法，所述方法包括步骤：用组合物处理真核细胞或生物体，其中所述组合物含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
[0022]本专利技术的再一个目的是提供胚胎、基因组修饰的动物或基因组修饰的植物，其包括由组合物编辑的基因组，所述组合物含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
[0023]本专利技术的另一个目的是提供一种制备基因组修饰的动物的方法，所述方法包括步骤：将含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质的组合物，引入动物胚胎中；和将胚胎转移到假孕代母的输卵管中，以产生基因组修饰的动物。
[0024]本专利技术的另一个目的是提供一种组合物，其用于在分离的生物样品中基因分型突变或变异，所述组合物包含特异于靶DNA序列的向导RNA和Cas蛋白质。
[0025]本专利技术的另一个目的是提供一种使用RNA向导核酸内切酶(RGEN)对细胞中由工程化的核酸酶诱导的突变或天然存在的突变或变异进行基因分型的方法，其中所述RGEN包含特异于靶DNA的向导RNA和Cas蛋白质。
[0026]本专利技术的另一个目的是提供对细胞中由工程化的核酸酶诱导的突变或天然存在的突变或变异进行基因分型的试剂盒，所述试剂盒含有RNA向导核酸内切酶(RGEN)，其本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于在真核细胞中使用II型成簇的规律间隔的短回文重复序列(CPISPR)/CPISPR关联蛋白质9(Cas9)系统切割靶DNA的方法，所述方法包含：将编码RNA向导Cas9核酸内切酶的核酸转染至所述真核细胞，其中在所述Cas9核酸内切酶的羧基末端具有添加的核定位序列(NLS)，并且其中所述Cas9核酸内切酶根据密码子使用表进行了密码子优化；转染包含tracrRNA部分和crRNA部分的单链向导RNA，其中所述crRNA部分能够与所述靶DNA杂交，并且其中所述tracrRNA部分与所述crRNA部分融合以形成单个分子；和将所述靶DNA与包含RNA向导Cas9核酸内切酶和所述单链向导RNA的所述CRISPR/Cas9系统接触，所述RNA向导Cas9核酸内切酶源自所述编码RNA向导Cas9核酸内切酶的核酸。2.如权利要求1所述的方法，其中将编码RNA向导Cas9核酸内切酶的核酸转染至所述真核细胞包括用编码RNA向导Cas9核酸内切酶的核酸对所述真核细胞进行电穿孔。3.如权利要求1所述的方法，其中将编码RNA向导Cas9核酸内切酶的核酸转染至所述真核细胞包括用编码RNA向导Cas9核酸内切酶的核酸核转染所述真核细胞。4.如权利要求1所述的方法，其中将编码RNA向导Cas9核酸内切酶的核酸转染至所述真核细胞后，转染包含tracrRNA部分和crRNA部分的单链向导RNA。5.用...

【专利技术属性】
技术研发人员：金进秀，曹承于，金素贞，J，
申请(专利权)人：基因工具股份有限公司，
类型：发明
国别省市：