一种用于研究针刀治疗DLBP作用机制的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于研究针刀治疗DLBP作用机制的方法，包括步骤：采用经皮细针穿刺纤维环的方式构建DLBP大鼠模型；对造模成功的DLBP大鼠模型进行分组，对各组大鼠眼眶采血，对血液生化指标、炎症因子表达检测；对模型干预组的DLPB大鼠模型进行针刀干预，每天观察大鼠的体态以及疼痛状态，处死后观察大鼠脊柱及脊旁组织形态学变化，测定脊旁细胞内游离Ca

【技术实现步骤摘要】
一种用于研究针刀治疗DLBP作用机制的方法


[0001]本专利技术涉及人中医针刀疗法领域，具体涉及一种用于研究针刀治疗DLBP作用机制的方法。

技术介绍

[0002]椎间盘源性腰痛（Discogenic Low Back Pain，DLBP）是腰部疼痛的主要原因，中医常将其归类于腰痛范畴。在腰痛的传统治疗中，针刺治疗表现出了非常好的治疗效果，而针刀治疗作为一种新兴的治疗方法，是中西医针具改良的典范，具有简便易学、效果明显等特点，已经在疼痛类疾病，尤其是慢性疼痛的临床治疗中广泛使用。针刀具有剥离松解、调控炎症因子、调节内源性神经递质、修复软组织损伤等作用。前期的一部分关于腰部疼痛的临床研究结果表明，患者在接受了针刀治疗后疼痛症状得到明显缓解，且复诊、和随访过程中并无复发迹象。
[0003]然而针刀治疗缓解患者腰部疼痛的潜在分子机制还未可知。通过对京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析数据库的筛选以及大量针刺与疼痛治疗相关文献的阅读，我们发现了瞬时感受器电位香草素（Transient Receptor Potential Vanilloid，TRPV）与针刺起效关系紧密。而Bidisha Dutta等研究发现，TRPV4信号通路在炎症反应中有重要作用，激活该通路可抑制炎症的发生。Brian G Lawhorn等综合文献，提出了激活TRPV4可以导致大量的Ca
+
离子内流，降低神经敏感性，可对疼痛起到明显抑制作用。同时，课题组针对针刀临床治疗进行了一系列的研究，均取得了满意治疗效果，但缺乏理论支撑，对针刀起效机制尚不明确。综合自身临床经验及类似文献报道，我们有理由认为TRPV4是针刀起效的关键点。
[0004]为此，我们在结合前期临床试验和文献调查的基础上提出针刀治疗DLBP的分子机制假说：“针刀刺激可以改善神经细胞离子通道异常情况，促进Ca
2+
的内流，并恢复动作电位的阈值，降低神经敏感性，达到镇痛的目的。同时针刀的刺激还可能转变成热能，加速血液循环，从而改善局部组织的营养供应和无菌性炎症因子的吸收，达到治疗的目的。TRPV4或将成为阐释针刀技术治疗起效机制的关键点，为更深入研究针刀与其他传统中医针刺疗法提供更多实验室数据。为了验证针刀治疗DLBP的分子机制假说的有效性，本专利技术提供了用于研究针刀治疗DLBP作用机制的方法，为该分子机制假说应用于临床上DLBP治疗提供理论支撑。

技术实现思路

[0005]为此，本专利技术了提供了用于研究针刀治疗DLBP作用机制的方法，包括以下步骤：S1、采用经皮细针穿刺纤维环的方式构建DLBP大鼠模型；S2、对造模成功的DLBP大鼠模型进行分组，包括健康对照组、模型对照组和模型干预组，针刀干预前、后分别对各组大鼠眼眶采血，进行血液生化指标，以及炎症因子表达检测；
S3、对模型干预组的DLPB大鼠模型进行针刀干预，每天观察大鼠的体态以及疼痛状态，于针刀干预12天后处死之，观察大鼠脊柱及脊旁组织形态学变化，利用新型Ca
2+
荧光探针指示剂Fura
‑
2测定脊旁细胞内游离Ca
2+
浓度，取大鼠脊旁病变组织进行固定及H&E染色，观察细胞形态的变化情况；S4、通过western blot、ELISA以及real
‑
time PCR技术检测各组大鼠中感受器电位香草素蛋白TRPV4、炎症细胞因子IL
‑
18、IL
‑
1β以及TNF
‑
α表达量的差异；S5、对所有的实验数据均采用Spss22.0统计学软件进行分析，利用GraphPad8.0进行图标制作，对研究样品数据资料以均值
±
标准差表示，各组之间进行配对t检验，组间比较进行独立的t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义；S6、通过显微镜下观察针刀治疗刺激前后组织的形态学对比，研究针刀治疗后局部病灶形态的改变，对比针刀干预治疗刺激前后病灶组织内炎性因子含量，结合Ca
2+
浓度的变化，从而可验证针刀刺激可以改善TRPV4信号通路异常情况，促进Ca2+的内流，并恢复动作电位的阈值，降低神经敏感性，达到镇痛的目的的假说。
[0006]进一步的，在所述步骤S1中，经皮细针穿刺纤维环的方式具体包括以下步骤：将SD大鼠仰卧固定，消毒、铺巾，便携式c臂机透视定位尾椎椎间隙，采用21g穿刺针穿刺SD大鼠腰椎L3/4、L4/5椎间盘，穿刺深度约为皮下5mm，随后将穿刺针旋转180度，停留约5s后，缓慢拔出穿刺针。
[0007]进一步的，在所述步骤S2中，采用热度痛觉测量仪和步态分析系统分析DLBP大鼠模型是否造模成功。
[0008]进一步的，在所述步骤S3中，针刀干预的方式为：大鼠进行横突旁的针刀治疗，定位更换为横突旁，刺入大鼠皮肤后针刀刀刃与脊柱纵轴一致，松解棘突旁后，退至浅层，倾斜刃口，呈八字型松解表层，稍加松解，拔出针刀，按压止血。
[0009]进一步的，在所述步骤S3中，H&E染色的步骤包括：将大鼠进行腹腔给药麻醉后，快速取出大鼠的脊髓、椎旁肌肉组织、脊柱L4
‑
6骨组织、脊柱L4
‑
6椎间盘组织，分别按实验室常规妥善保存，对组织进行HE染色，显微镜下观察，各组大鼠脊柱组织结构的变化。
[0010]进一步的，在所述步骤S3中，利用新型Ca
2+
荧光探针指示剂Fura
‑
2测定脊旁细胞内游离Ca2+浓度的步骤包括：将剥离的椎旁肌肉组织、椎间盘组织剥离，剪碎后制备成细胞悬液，加入于37℃预温的Fura
‑
2/AM，37℃恒温振荡孵育30min后，清洗多余的荧光染料，测定细胞的荧光值。激发波长为340nm,发射波长为510nm，利用所测的荧光值强度推算细胞内Ca
2+
浓度，具体计算公式为：[Ca
2+
]浓度＝K
d
(F
‑
F
min
)/(F
max
‑
F)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
（1），式中K
d
为Fura
‑2‑
Ca
2+
复合物的有效解离常数，生理条件下为224nmol/L；F
max
为波长为510nm时测的荧光强度，F
min
为波长为240nm时测的荧光强度；F为Fura
‑
2／AM与细胞孵育后细胞悬液的荧光强度。
[0011]进一步的，在所述步骤S4中，ELISA检测步骤包括：将处死的DLBP大鼠模型的脊髓、椎旁肌肉组织、脊柱L4
‑
6骨组织、脊柱L4
‑
6椎间盘组织进行研磨、匀浆，以生理盐水按1：10比例制备组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于研究针刀治疗DLBP作用机制的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、采用经皮细针穿刺纤维环的方式构建DLBP大鼠模型；S2、对造模成功的DLBP大鼠模型进行分组，包括健康对照组、模型对照组和模型干预组，针刀干预前、后分别对各组大鼠眼眶采血，进行血液生化指标，以及炎症因子表达检测；S3、对模型干预组的DLPB大鼠模型进行针刀干预，每天观察大鼠的体态以及疼痛状态，于针刀干预12天后处死之，观察大鼠脊柱及脊旁组织形态学变化，利用新型Ca
2+
荧光探针指示剂Fura
‑
2测定脊旁细胞内游离Ca
2+
浓度，取大鼠脊旁病变组织进行固定及H&E染色，观察细胞形态的变化情况；S4、通过western blot、ELISA以及real
‑
time PCR技术检测各组大鼠中感受器电位香草素蛋白TRPV4、炎症细胞因子IL
‑
18、IL
‑
1β以及TNF
‑
α表达量的差异；S5、对所有的实验数据均采用Spss22.0统计学软件进行分析，利用GraphPad8.0进行图标制作，对研究样品数据资料以均值
±
标准差表示，各组之间进行配对t检验，组间比较进行独立的t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义；S6、通过显微镜下观察针刀治疗刺激前后组织的形态学对比，研究针刀治疗后局部病灶形态的改变，对比针刀干预治疗刺激前后病灶组织内炎性因子含量，结合Ca
2+
浓度的变化，从而可验证针刀刺激可以改善TRPV4信号通路异常情况，促进Ca2+的内流，并恢复动作电位的阈值，降低神经敏感性，达到镇痛的目的的假说。2.根据权利要求1所述的用于研究针刀治疗DLBP作用机制的方法，其特征在于，在所述步骤S1中，经皮细针穿刺纤维环的方式具体包括以下步骤：将SD大鼠仰卧固定，消毒、铺巾，便携式c臂机透视定位尾椎椎间隙，采用21g穿刺针穿刺SD大鼠腰椎L3/4、L4/5椎间盘，穿刺深度约为皮下5mm，随后将穿刺针旋转180度，停留约5s后，缓慢拔出穿刺针。3.根据权利要求1所述的用于研究针刀治疗DLBP作用机制的方法，其特征在于，在所述步骤S2中，采用热度痛觉测量仪和步态分析系统分析DLBP大鼠模型是否造模成功。4.根据权利要求1所述的用于研究针刀治疗DLBP作用机制的方法，其特征在于，在所述步骤S3中，针刀干预的方式为：大鼠进行横突旁的针刀治疗，定位更换为横突旁，刺入大鼠皮肤后针刀刀刃与脊柱纵轴一致，松解棘突旁后，退至浅层，倾斜刃口，呈八字型松解表层，稍加松解，拔出针刀，按压止血。5.根据权利要求1所述的用于研究针刀治疗DLBP作用机制的方法，其特征在于，在所述步骤S3中，H&E染色的步骤包括：将大鼠进行腹腔给药麻醉后，快速取出大鼠的脊髓、椎旁肌肉组织、脊柱L4
‑
6骨组织、脊柱L4
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6椎间盘组织，分...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆华龙，熊伟，程凌，李松，叶晓波，
申请(专利权)人：南昌市洪都中医院，
类型：发明
国别省市：